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整合素ανβ6与ERK-ETS1信号通路在调控结肠癌侵袭转移中的作用机制研究

高会杰  
【摘要】:研究背景结肠癌在全世界恶性肿瘤中发病率排第三位,在病死率方面排第四位。大约20%的患者在诊断时已经发生了远处转移,其余的患者在肿瘤的进展过程中也会发生转移。因此,明确结肠癌的侵袭和转移机制对于更好的治疗结肠癌和降低患者死亡率方面具有十分重要的意义。基质金属蛋白酶(MMPs)通过降解基质膜和细胞外基质等手段在各种病理过程中发挥了重要的作用,其中有一些MMPs则可以引起肿瘤的侵袭和转移。许多重要的基础研究和临床试验结果表明,在结肠癌发生转移的患者中,基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-3和MMP-9的表达均有不同程度的明显升高。MMPs转录水平受到周围组织、细胞外基质、激素以及其他多种因子的调节。整合素属于一类粘附分子家族,每个整合素分子由α和β两种亚基通过共价键组成,是一种跨膜糖蛋白受体,介导细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的联系。整合素αvβ6是唯一一种含有p6亚基的整合素,其仅在上皮细胞中表达。该整合素在成人的健康组织细胞中低表达或不表达,但是在胚胎发生、组织修复以及肿瘤组织中表达升高。我们之前在胃癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌等不同的恶性肿瘤中报道过整合素αvβ6在细胞外基质的降解以及肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要的作用。最近我们发现整合素αvβ6可以通过其自身的内吞胞吐作用在细胞质和细胞膜之间进行穿梭,这种穿梭对结肠癌细胞通过与纤维连结蛋白(fibronectin)相连进行不断的迁移起到了关键作用,从而揭示了整合素αvβ6在促进结肠癌发生发展过程中的一种重要机制。我们之前还曾报道过在结肠癌细胞中,整合素αvβ6中的p6亚基与细胞外调节蛋白激酶2(ERK2)之间存在直接连接,而抑制此直接连接会显著降低ERK2的激酶活性、αvβ6依赖性的细胞密度以及αvβ6介导的MMP-9的表达。但是αvβ6与MMPs之间的具体关系以及αvβ6如何调节MMPs表达的机制仍然不明确。搞清该信号通路上有无其他重要转录因子及其他蛋白质参与对于寻找αvβ6阳性的结肠癌患者的治疗具有重要的意义。ETS转录因子家族的蛋白质结构中普遍有一个螺旋转螺旋的结构,该结构中有一个高度保守ETS结构域,可以与DNA序列GGA(A/T)特异性识别并结合。在许多MMP基因的启动子中含有该ETS结合序列(EBS)。ETS家族的转录因子大约共有200多个靶基因,涉及如血管生成,细胞生长以及细胞凋亡等多项生物学过程。在各种不同的转录因子中,研究人员发现ETS1、ETS2以及ELK1具有促进肿瘤转移的功能。我们推测ETS可能参与了αvβ6促进MMP基因表达的过程。ETS在多种肿瘤中被发现与整合素共表达。但是αvβ6, MAPK信号通路,ETS家族转录因子以及MMPs之间有着怎样的联系仍然不明确。在本研究中,我们主要探讨αvβ6促进MMP基因表达的机制,以及在该过程中ETS是否有参与以及伴随着怎样的角色。第一部分整合素αvβ6对结肠癌细胞侵袭转移的影响目的研究整合素αvβ6对MMPs在mRNA和蛋白水平上表达的影响。方法1.将HT-29或者WiDr细胞系分别分成三组:野生组(wild-type)-.干扰p6组(Antisence β6)、对照组(control or mock)。将SW480细胞系分成三组:SW480野生型(wild type)、空白质粒对照组(mock transfected)以及β6转染组(β6 transfected)。通过流式细胞技术以及western blot两种方法分别进行检测整合素αvβ6的表达情况,以检验我们的干扰效果,为进行后续实验做准备。2.利用quantitative Real-time PCR技术,对前述的各组结肠癌细胞中的有关MMPs的表达进行mRNA水平的检测。3.对相关的MMPs的表达情况采用ELISA方法进行蛋白水平检测。结果1.在结肠癌细胞系SW480中,流式细胞技术以及western blot两种方法均显示SW480野生型(wild type)、空白质粒对照组(mock transfected)不表达整合素p6,p6转染组(β6 transfected)中的p6表达明显升高。另外,在各组细胞中整合素αv亚基表达无明显差异。2.在结肠癌细胞系HT29与WiDr中,干扰p6表达后,流式细胞技术以及western blot两种方法均显示:与野生型(wild type)和空白质粒对照组(mock transfected)相比,p6干扰组(β6 Antisence) β6表达明显降低。此外,各组细胞的整合素αv亚基表达无明显差异。3. Real-time PCR结果显示,在结肠癌细胞系HT29与WiDr中,相比较野生型(wild type)口空白质粒对照组(mock transfected),我们发现p6干扰组(p6antisense)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9的mRNA表达显著降低,而其他几种MMPs,包括MMP-1、MMP-7以及MMP-13,在干扰β6后表达无明显变化。4. Real-time PCR结果显示,在结肠癌细胞系SW480中,相比较SW480野生型(wild type)和空白质粒对照组(mock transfected),β6转染组(β6 transfected)中的MMP-2、MMP-3以及MMP-9的mRNA表达显著升高,而其他几种MMPs,包括MMP-1、MMP-7以及MMP-13无明显变化。5. ELISA方法进行蛋白水平检测结果显示:在结肠癌细胞系HT29与WiDr中,相比较野生型(wild type)和空白质粒对照组(mock transfected),我们发现β6干扰组(β6 antisense)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9的蛋白表达量均显著降低。6. ELISA方法进行蛋白水平检测结果显示,在结肠癌细胞系SW480中,相比较SW480野生型(wild type)和空白质粒对照组(mock transfected),β6转染组(β6transfected)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9蛋白量均显著升高。结论及意义本部分旨在研究整合素αvβ6对MMPs在mRNA和蛋白水平上表达的影响,首先通过质粒转染等手段在结肠癌细胞系(包括SW480、HT29以及WiDr)过表达或者干扰整合素中p6的表达,并进一步通过流式细胞技术以及western blot两种方法分别进行检验我们的干扰效果,为进行后续实验做准备。接下来通过quantitative Real-time PCR技术和ELISA方法来检测整合素αvβ6对MMPs在mRNA和蛋白水平上表达的影响。本部分结果显示,整合素αvβ6可以促进MMP-2、 MMP-3以及MMP-9的表达,对整合素αvβ6的理论知识进一步丰富,并为下一步研究整合素αvβ6促进结肠癌侵袭转移机制的研究打下基础。染组(β6transfected)中MMP-2、MMP-3以及MMP-9蛋白量均显著升高。结论及意义本部分旨在研究整合素αvβ6对MMPs在mRNA和蛋白水平上表达的影响,首先通过质粒转染等手段在结肠癌细胞系(包括SW480、HT29以及WiDr)过表达或者干扰整合素中p6的表达,并进一步通过流式细胞技术以及western blot两种方法分别进行检验我们的干扰效果,为进行后续实验做准备。接下来通过quantitative Real-time PCR技术和ELISA方法来检测整合素αvβ6对MMPs在mRNA和蛋白水平上表达的影响。本部分结果显示,整合素αvβ6可以促进MMP-2、 MMP-3以及MMP-9的表达,对整合素αvβ6的理论知识进一步丰富,并为下一步研究整合素αvβ6促进结肠癌侵袭转移机制的研究打下基础。第二部分转录因子ETS1介导整合素αvβ6调控MMPs机制研究目的研究转录因子ETS1对αvβ6调控MMPs的影响。方法1.细胞分组同第一部分。2.采用Real-time PCR和Western blot检测各组细胞中αvβ6的表达以及ETS家族相关转录因子ETS1、ETS2以及ELK1的表达。3.采用荧光素酶报告基因(Luciferase)检测方法,检测整合素αvβ6诱导MMP-3和MMP-9基因表达过程中是否涉及转录因子ETS1。4.采用ERK抑制剂PD98059,检测在整合素p6活化ETS1过程中是否涉及ERK/MAPK信号通路。5.采用primaquine阻断αvβ6质膜穿梭,对ETS1的活性进行检测检测在整合素β6活化ETS1过程中是否涉整合素αvβ6质膜穿梭。6.整合素αvβ6-ERK2直接连接在整合素β6活化ETS1过程中作用研究,为研究avp6-ERK2直接连接是否在αvβ6在促进ETS1活化过程中发挥作用,我们将SW480细胞转染含有β6突变基因质粒(转染后表达的β6蛋白缺少与ERK2的结合位点:746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764(下划线表示整合素β6胞内段中与ERK2结合序列)。结果1. Real time-PCR和Western blot结果显示,在结肠癌细胞系HT29与WiDr中,干扰β6的表达后,ETS1、ETS2以及ELK1的总的mRNA和蛋白表达量无明显改变,而ETS1的活化形式—磷酸化ETS1 (p-ETS1)表达量明显下降,磷酸化ETS2 (p-ETS2)和磷酸化ELK1 (p-ELK1)仍然没有变化。2.在结肠癌细胞系SW480中,过表达β6之后,相较于野生型SW480和mockSW480,磷酸化ETS1 (p-ETS1)明显升高,磷酸化ETS2 (p-ETS2)和磷酸化ELK1 (p-ELK1)未见明显改变3. Luciferase结果显示,将ETS1 siRNA转入HT29与WiDr细胞系中,MMP-3和MMP-9的启动子活性有明显降低,而MMP-2的活性无明显变化。4.在干扰整合素αvβ6的HT29与WiDr细胞系中,MMP-3和MMP-9的启动子活性,相较于野生型HT29与WiDr明显降低。5.在SW480中,过表达整合素αvβ6后,MMP-3和MMP-9的启动子活性明显升高,转入ETS1 siRNA后,升高的活性再次降低。而MMP-2基因启动子活性虽然在过表达整合素αvβ6后有所升高,但在转入ETS1 siRNA抑制ETS1表达后,升高的MMP-2基因启动子活性并没有再次降低。6.在HT29与WiDr细胞系中,加入PD98059后,磷酸化ETS1(p-ETS1)明显升高,而总的ETS1的表达量没有明显改变,而在SW480中加入PD98059后,原来因转入β6而导致的升高的p-ETS1的则再次降低。7.在HT29与WiDr细胞系中,加入primaquine后,磷酸化ETS1 (p-ETS1)明显降低,而总的ETS1的表达量没有明显改变,而在SW480中加入primaquine后,原来因转入β6而导致的升高的p-ETS1的则再次降低。8. 转染β6组与空白质粒转染组相比,ETS1的活性明显升高,而转染了含有敲除p6蛋白与ERK2的结合位点的β6后,ETS1的活性并未增加。结论及意义本部分实验揭示,结肠癌细胞系HT29与WiDr中,整合素αvβ6均可有效的促进ETS1的活化,在结肠癌细胞系SW480,过表达β6之后亦可促进ETS1的磷酸化。同时,ETS1可以提高MMP-3和MMP-9启动子的活性,ERK/MAPK信号通路,整合素αvβ6质膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接连接在转录因子ETS1介导整合素αvβ6调控MMPs机制研究过程中发挥了不可或缺的作用。本部分研究明确了整合素αvβ6在基因转录层面上调控MMPs表达的具体机制,为下一步研究整合素avβ6促进结肠癌侵袭转移机制的研究打下基础。8. 转染β6组与空白质粒转染组相比,ETS1的活性明显升高,而转染了含有敲除p6蛋白与ERK2的结合位点的β6后,ETS1的活性并未增加。结论及意义本部分实验揭示,结肠癌细胞系HT29与WiDr中,整合素αvβ6均可有效的促进ETS1的活化,在结肠癌细胞系SW480,过表达β6之后亦可促进ETS1的磷酸化。同时,ETS1可以提高MMP-3和MMP-9启动子的活性,ERK/MAPK信号通路,整合素αvβ6质膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接连接在转录因子ETS1介导整合素αvβ6调控MMPs机制研究过程中发挥了不可或缺的作用。本部分研究明确了整合素αvβ6在基因转录层面上调控MMPs表达的具体机制,为下一步研究整合素avβ6促进结肠癌侵袭转移机制的研究打下基础。第三部分整合素αvβ6通过ERK-ETS1通路促进结肠癌细胞侵袭转移目的研究整合素αvβ6促进结肠癌细胞侵袭转移相关细胞信号传导通路。方法1.在HT29与WiDr细胞系中,加入PD98059, primaquine或者ETS1 siRNA之后,Real-time PCR和ELISA检测MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表达变化。2.在已经稳定干扰β6表达的HT29与WiDr中转入pcDNA-ETS1质粒,Real-timePCR和ELISA检测其MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表达变化。3.在过表达β6的SW480中,加入PD98059, primaquine,或者ETS1 siRNA之后,Real-time PCR和ELISA检测MMP-3/MMP-9在mRNA和蛋白水平上表达变化。4.在HT29细胞中,给予整合素β6抗体10D5对整合素β6进行阻断,使用PD98059抑制ERK活化,或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表达,采用Transwell侵袭小室和细胞划痕实验检测HT29的侵袭和迁移能力变化。5.将SW480细胞分为三组:转染空白质粒组(mock transfectant),转染p6组(β6 transfectant),以及转染含有β6突变基因质粒组(SW480 Mutant β6 transfectant),在各组细胞中,加入10D5阻断整合素β6,给予抑制剂PD98059抑制ERK活化或者给予ETS1 siRNA抑制ETS1表达之后,采用Transwell侵袭小室和细胞划痕实验检测各组细胞侵袭和迁移能力变化。结果1. Real-time PCR结果显示在HT29与WiDr细胞系中,加入PD98059,primaquine或者ETS1 siRNA之后,MMP-3/MMP-9在mRNA表达量明显下降。同时ELISA结果显示MMP-3/MMP-9在蛋白水平上表达同样明显降低。2.在已经稳定干扰β6表达的HT29与WiDr中转入pcDNA-ETS1质粒,Real-timePCR和ELISA结果显示,在mRNA和蛋白水平上,干扰β6所引起的下降的MMP-3/MMP-9,在过表达ETS1之后均再次上升。3.在过表达β6的SW480中,Real-time PCR和ELISA结果显示,因过表达p6而表达增加的MMP-3/MMP-9,在加入PD98059,primaquine,或者ETS1siRNA之后再次降低。4.在HT29细胞中,与未作任何处理的野生型HT29细胞相比,给予整合素β6抗体10D5对整合素β6进行阻断,使用PD98059抑制ERK活化,或者采用ETS1 siRNA抑制ETS1表达均可明显减弱HT29的侵袭或者迁移能力。5.在转染p6的SW480中组中,加入10D5阻断整合素β6,给予抑制剂PD98059抑制ERK活化或者给予ETS1 siRNA抑制ETS1表达,Transwell侵袭小室实验和细胞划痕实验显示细胞的侵袭或者迁移能力明显下降,相对而言,加入IgG2a并未影响细胞的侵袭能力,而在SW480 mock transfectant 和 Mutant p6 transfectant组中,细胞的侵袭和迁移能力没有降低。结论及意义本部分实验揭示,整合素αvβ6通过ERK-ETS1通路促进结肠癌细胞侵袭转移,并与整合素αvβ6质膜穿梭和整合素αvβ6-ERK2直接连接密不可分。本部分研究明确了整合素αvβ6结肠癌细胞侵袭转移的具体机制,对整合素αvβ6的理论知识进一步丰富,并为研究与整合素αvβ6相关的靶向治疗药物来抑制结肠癌侵袭转移打下基础。


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