IL-13对大鼠佐剂性关节炎的作用及相关机制研究

【摘要】：目的：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)简称类风湿,是一种病因复杂且无特异性诊断指标的慢性、自身系统性免疫炎性疾病,累及多关节及关节外器官,严重影响患者的身心健康及生活质量。目前,仍缺乏具有特异疗效且副作用小的治疗药物,因此,探索效果显著、无副作用或副作用较小的天然活性成分已成为研究RA药物的热点。白介素13 (Interleukin-13,IL-13)是一种天然的抗炎性细胞因子,具有广泛的生物学效应。结合IL-13具有的免疫刺激和免疫抑制共存的生物学活性,其已成为多种过敏及免疫性疾病在临床研究和治疗中的一个重要靶点；同时IL-13也具有较强的抗炎效应,可抑制一系列由TNF-α引起的疾病病情的进程。因此,IL-13有望成为治疗RA的一种天然活性成分。本课题通过建立佐剂性关节炎大鼠模型,研究抗炎性细胞因子IL-13对其的作用,并对其作用机制进行初步研究。方法：1.采用弗式完全佐剂建立大鼠关节炎模型,并利用分析天平测量实验大鼠体重,使用足趾容积测量仪测定大鼠的足趾容积,采用评分法(0～4分)对实验大鼠的关节炎指数进行评价,进一步通过增重率、足趾肿胀程度、关节炎指数及脾脏指数对AA大鼠进行评价；2.通过增重率、足趾肿胀程度、关节炎指数及脾脏指数初步检测IL-13对AA大鼠的作用,并进一步应用ELISA法测定AA大鼠血浆炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度；3.应用脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导RAW264.7细胞建立体外炎症细胞模型,以研究IL-13抗关节炎的作用机制,应用MTT法测定IL-13对LPS模型组细胞增殖作用的药效曲线,ELISA法测定细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6的浓度,Western blotting检测MAPK和NF-κB信号通路相关蛋白的磷酸化程度。结果：1.佐剂性关节炎大鼠模型的建立与评价：与对照组大鼠相比,右后足趾皮内注射CFA的模型组大鼠自14d起,增重率明显下降,且随时间延长,与对照组的差异逐渐增大,在第30 d达到最大,此时的增重率为54.98%,而对照组大鼠的增重率已达94.87%；在造模14d时模型组大鼠出现明显的关节炎症状,即大鼠对侧脚及尾根出现肿胀、爪子表面有红斑,足趾的肿胀率达到65.73%,与空白对照组有显著差异(P0.01)。22 d左右达到高峰,此时模型大鼠行动不便,表现为对侧及前足肿胀,耳和尾根出现明显关节炎结节,骨骼也明显变形、间隙变大；与对照组大鼠相比,模型组大鼠的脾脏明显增生。以上结果表明本实验利用CFA成功建立了AA大鼠模型,可用于进一步的实验研究。2.IL-13对佐剂性关节炎大鼠的作用：与AA模型大鼠相比,低、中、高剂量的IL-13均能提高大鼠的增重率；中、高剂量的IL-13能显著(P0.05)降低关节炎指数,在致炎第30 d时,模型组大鼠关节炎指数为3.25,而中、高剂量IL-13组分别降至1.31、1.21；低、中、高剂量的IL-13均可降低AA大鼠的足趾肿胀率,且随时间延长,IL-13中、高剂量组可显著降低大鼠的足趾肿胀率,在致炎第30d时,模型组大鼠足趾肿胀率为65.85%,中、高剂量组已降至56.75%、54.26%；重组IL-13各剂量组均可不同程度降低造模大鼠的脾指数,中、高剂量组与模型组相比,脾指数显著降低(P0.05,P0.01); ELISA结果显示,中、高剂量IL-13组大鼠血清中IL-1β(74.35 pg/mL、63.75 pg/mL)、TNF-α(223.76 pg/mL 190.45 pg/mL)和IL-6(106.85 pg/mL、92.86 pg/mL)的含量均极显著地低于模型组的(**P0.01)。因此,本研究认为IL-13能在一定程度上减轻AA大鼠的关节炎症状并恢复部分免疫功能,可能与IL-13降低血清中炎性因子L-1β、TNF-a和IL-6的含量相关。3.IL-13对AA大鼠模型作用的机制研究：LPS刺激可导致RAW264.7细胞内IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量显著上升(P0.05),且引起MAPK和 NF-κB信号通路活化。当终浓度为2、10、50μM的IL-13存在的情况下,均可显著地降低LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中的IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白含量(P0.05),且呈现剂量依赖性地降低；10μM和50μM的IL-13可明显抑制致炎RAW264.7细胞中P38和ERK的磷酸化程度,对JNK的磷酸化程度基本无影响,而50μM的阿司匹林对P38和ERK的磷酸化都无明显影响；2μM/10μM和50μM的IL-13处理致炎的RAW264.7细胞后,IκB、P65的磷酸化程度明显降低,而50 μM的阿司匹林却不能抑制IκB、P65的磷酸化。因此,IL-13可明显降低致炎细胞中炎性细胞因子的分泌,抑制致炎细胞中MAPK和NF-κB信号通路的活化,这可能是IL-13抗炎效应的机制,亦即IL-13抑制AA病理过程和恢复病情的一种机制。结论：本实验利用CFA成功建立了具备典型类风湿性关节炎症状的的AA大鼠模型,并证明IL-13能在一定程度上改善AA模型大鼠的关节炎症状,降低血清中炎症因子的浓度,控制关节炎病情的进展；体外细胞实验表明,IL-13可明显降低炎性细胞因子的含量,抑制MAPK和NF-κB信号通路的活化,提示IL-13具有较强的抗炎效应,这可能是IL-13抑制AA病理进程的一种机制。意义：1.研究了IL-13对AA大鼠的抗关节炎作用；2.研究了IL-13抗关节炎作用的机制；3.为类风湿性关节炎的研究及治疗提供了新的靶点。