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黄芪甲苷对TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响及作用机制

牛珩  
【摘要】:目的近年来经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneous coronary intervention,PCI)已广泛应用于冠心病的治疗,但术后再狭窄(restenosis, RS)的发生严重影响了其远期疗效。RS的发生机制尚未完全阐明,目前研究认为血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)在各种刺激因素下发生表型转换,通过细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解由血管中膜向内膜下迁移、增殖,进而形成新生内膜是PCI术后再狭窄发生的关键性起始步骤。黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ)是从传统中药黄芪中分离得到的一种具有多种药理活性的皂苷类化合物,既往研究表明AS-Ⅳ具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗心肌纤维化及改善心功能等作用。但目前尚未有关于AS-Ⅳ防治PCI术后再狭窄的研究。本研究通过建立体外大鼠VSMCs增殖、迁移模型,观察AS-Ⅳ在肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的诱导下,对离体大鼠VSMCs增殖、迁移的影响及其作用机制,以期为PCI术后再狭窄的药物治疗提供一条新的思路。方法(1)采用组织贴块法培养大鼠血管平滑肌细胞,倒置显微镜和平滑肌肌动蛋白(α-SM-actin)进行细胞形态学和免疫组织化学鉴定,为下一步的研究提供实验材料。(2)以重组大鼠TNF-α (100ng/ml)作为刺激因素,建立体外平滑肌细胞增殖、迁移模型,并分组如下:①对照组;②TNF-α组;③ TNF-α+ AS-IV 0.5ug/ml; ④ TNF-a+AS-IV 5ug/ml; ⑤ TNF-α+AS-IV 25ug/ml; ⑥ TNF-α+AS-IV 50 ug/ml。(3)应用CCK-8法检测AS-Ⅳ对TNF-α诱导的VSMCs增殖能力影响。(4)应用划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测AS-Ⅳ对TNF-α诱导的VSMCs迁移、侵袭能力影响。(5)应用Real-time PCR和Western-blot实验分别检测AS-Ⅳ对TNF-α诱导的VSMCs分泌的MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA和蛋白表达水平的影响。结果(1)90%以上组织块接种存活,培养5代的VSMCs纯度达95%以上,倒置显微镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷”状生长结构,经免疫细胞化学染色后发现98%的细胞染色阳性。(2)在TNF-α刺激下,VSMCs增殖活性、迁移距离、侵袭能力与对照组相比均明显提高,差异显著(P0.01),提示TNF-α可促进VSMCs的增殖、迁移,成功建立了体外细胞实验模型。(3)CCK-8实验结果显示:细胞经TNF-α孵育至预定时间后,细胞增殖明显,OD值上升,与对照组相比差异显著(P0.001)。经药物预处理后,各浓度组细胞增殖均受到抑制,OD值降低,与同期TNF-α组相比差异显著(P0.05),且随着药物浓度和作用时间的增加,细胞生长抑制更加明显,提示AS-Ⅳ以时间和浓度依赖方式抑制了TNF-α诱导的VSMCs增殖。(4)划痕实验结果显示:细胞经TNF-α孵育至预定时间后,镜下可见VSMCs从划痕边缘向中间成束迁移,与对照组相比,迁移能力明显提高(P0.05)。经药物干预后,细胞迁移距离较TNF-α组缩短(P0.05),且随着药物浓度和作用时间的增加,细胞迁移距离缩短的更加明显。提示AS-Ⅳ以时间和浓度依赖方式抑制了TNF-α诱导的VSMCs迁移。(5)细胞侵袭实验结果显示:TNF-α可刺激VSMCs穿过微孔滤膜,从上室进入下室,通过细胞计数发现迁移细胞数与对照组相比,差异显著(P0.01),经药物预处理培养24h后发现:各浓度组穿膜细胞数较TNF-α组明显减少,且具有浓度依赖性(P0.01)。提示:AS-Ⅳ以浓度依赖方式抑制了TNF-α诱导的VSMCs侵袭。(6)Real-time PCR和Western-blot实验结果显示:TNF-α能够通过诱导actMMP-2、MMP-9和TIMP-1的合成,对proMMP-2及TIMP-2的表达无明显影响来改变MMPs与TIMPs的比例,进而促进ECM的降解。经药物干预后,AS-Ⅳ以浓度依赖方式通过下调TNF-α诱导的MMP-2和MMP-9过表达,上调TIMP-1和TIMP-2的mRNA及蛋白表达恢复MMPs与TIMPs的比例,使ECM降解减少,从而实现对VSMCs增殖、迁移的抑制作用。结论1.黄芪甲苷能够以时间和浓度依赖方式抑制TNF-α诱导的VSMCs增殖、迁移及侵袭;2.黄芪甲苷通过下调TNF-α诱导的MMP-2和MMP-9过表达,上调TIMP-1和TIMP-2的表达恢复MMPs与TIMPs的比例,使ECM降解减少,限制了VSMCs的迁移、增殖,从而实现对PCI术后再狭窄的防治作用。


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