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生长停滞特异性蛋白-6对血管平滑肌细胞衰老影响的研究

靳成伟  
【摘要】:研究背景衰老是身体机能、适应性以及抵抗力随着时间的推移而逐渐降低的一种现象。现如今,随着全球人口老龄化步伐的加快,衰老正逐步成为全球关注的焦点:由于衰老与人类的寿命以及生活质量关系密切,因此,能否延缓衰老对于提高人们的生活质量以及延长寿命尤为重要。研究显示,衰老逐步成为心血管系统的首要危险因素:衰老可以影响心血管系统的代谢并因此导致细胞外基质的代谢紊乱、异常的细胞死亡以及炎症的发生;从而使心血管系统的结构和功能发生改变,最终导致心血管重构。Growth arrest-specific protein 6 (Gas6)是由growth arrest-specific gene 6(gas6)基因所编码的一种分泌型蛋白,隶属于维生素K依赖性蛋白家族成员。多项研究显示Gas6/Axl信号参与血管钙化、血管重塑以及动脉粥样硬化等病理生理过程。此外,基因多态性分析显示,gas6基因与急性冠脉综合征以及中风关系密切。根据上述观点和理论可以推断:Gas6/Axl信号与心血管系统疾病的发生发展具有重要的理论和实际意义。然而,Gas6/Axl信号对心血管系统衰老的影响以及具体的作用机制尚不明确。因此,本研究将对Gas6/Axl信号对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)衰老的影响进行研究探讨。研究目的1.探讨Gas6对细胞衰老的影响2.探讨Gas6对细胞衰老影响下的信号转导通路3.探讨Gas6参与细胞衰老调节的具体作用机制材料方法本研究以MOVAS小鼠主动脉平滑肌细胞系及原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞为研究对象,应用蛋白免疫印迹(Western Blotting)、衰老相关β-半乳糖苷酶染色(Senescence-associated β-galactosidase staining, SA-β-Gal)、流式细胞术(Flow cytometry)、细胞转染小干扰RNA (si-RNA)、以及EdU荧光标记法等实验方法,分别观察以下指标:1.细胞衰老模型的建立以及鉴定情况。2.使用多个浓度梯度的Gas6蛋白刺激原代细胞,通过检测p16INK4a和p21Cipl蛋白表达情况以及β-半乳糖苷酶染色率情况,得出Gas6刺激的最佳时间点以及最适浓度。3.给予细胞重组游离型Axl蛋白(Axl-Fc)刺激,用以中和细胞上清中的Gas6,降低其上清中的浓度。进一步检测细胞p16INK4a和p21Cipl衰老相关蛋白表达情况以及β-半乳糖苷酶染色率的情况。4.使用Axl特异性阻断剂R428干预细胞,观察细胞的衰老情况。5. 使用流式细胞技术和EdU标记法分别检测细胞周期和细胞增殖情况,分析以上六组细胞周期分布情况以及细胞增殖变化。6. 分别使用Axl和磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)的特异性阻断剂R428和LY294002刺激两个衰老模型的细胞,分别观察下游分子PI3K、Akt、FoxO3a、P27Kipl和cyclin E以及Akt、FoxO3a、p27Kipl和cyclin E表达改变情况。7.使用设计、化学合成FoxO3a siRNA,采用脂质体转染MOVAS细胞系,以抑制FoxO3a的合成和表达,观察FoxO3a对细胞周期的影响。结果1.衰老模型的鉴定衰老相关p半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色和Western Blotting结果显示,当原代VSMC传至第10代时,细胞SA-β-Gal染色率可达80%以上,较对照组明显增加(P0.001);另外,衰老相关分子指标p16INK4a和p21Cipl较对照组(第3代)明显增加(P0.001,P0.001)。我们选用第4代原代VSMC,使用1*10-6mol/L浓度的血管紧张素Ⅱ连续刺激48小时后的细胞作为诱导衰老模型(Induced Senescence, IS)。2.Gas6延缓细胞的衰老过程分别使用多个浓度梯度和时间点的Gas6刺激细胞,通过Western blotting,发现使用250 ng/mL的Gas6连续刺激细胞36小时,衰老相关分子指标p16INK4a和p21Cipl较对照组明显降低(P0.05,P0.001)3.Axl是介导Gas6发挥抗衰老作用的主要受体在给与细胞R428刺激后,无论是否给予Gas6干预,p16INK4a和p21Cipl的蛋白表达水平以及SA-β-Gal染色率明显高于未给予R428刺激组(P0.001,P0.001,P0.01)。而这两组细胞的p16INK4a和p21Cipl的蛋白表达水平以及SA-β-Gal染色率水平却无明显差异。4.Gas6促进细胞G1/S期的转位并提高细胞的增殖水平在两组衰老模型细胞中,再给予Gas6干预后,细胞均显示出G1期的降低以及S期的增加(P0.05,P0.05),而年轻组细胞在给与Gas6干预后较其对照组尚无明显改变。另外,在两组衰老模型细胞中,在给与Gas6干预后,其增殖水平均较其对照组明显增加(P0.05,P0.05)。5. PI3K/Akt/FoxO信号通路参与Gas6抗细胞衰老作用的过程在诱导衰老模型中,给予R428干预后,PI3K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平较对照组明显降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.05),而p27kipl水平较对照组明显增高(P0.01);在复制衰老模型中,在给与细胞R428干预后,P13K、p-Akt、p-FoxO3a以及cyclin E水平较对照组明显降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.05),而p27kipl水平较对照组明显增高(P0.01)另外,我们使用PI3K的特异性阻断剂LY294002干预后,检测其下游通路的变化。在诱导衰老模型中,给予LY294002干预后,p-Akt、p-FoxO3a以及cyclinE水平较对照组明显降低(P0.05,P0.05,P0.01),而p27kip1水平较对照组明显增高(P0.01);在复制衰老模型中,在给与细胞LY294002干预后,p-Akt、 p-FoxO3a以及cyclin E水平较对照组明显降低(P0.01,P0.05,P0.01,P0.01),而p27kip1水平较对照组明显增高(P0.05)6.FoxO是受Gas6调节的关键作用因子使用Fox03a-siRNA转染MOVAS细胞后,p27kipl表达水平明显增高(P0.01),而cyclin E表达水平明显降低(P0.05);另外,通过细胞周期分析,FoxO3a-siRNA转染后细胞较对照组其G1期增高而S期降低(P0.01)结论1.Gas6延缓细胞的衰老过程;2.Axl是介导Gas6发挥抗衰老作用的主要受体;3.Gas6促进细胞G1/S期的转位并提高细胞的增殖水平;4. PI3K/Akt/FoxO信号通路参与Gas6延缓细胞衰老作用的过程;5. FoxO是受Gas6调节的关键作用因子。


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