急性髓系白血病中SMG1与mTOR信号通路的相互作用机制研究

【摘要】：研究背景： 急性髓系白血病(AML)是以骨髓中髓系细胞及其前体细胞的增殖异常和分化阻滞为特征的造血系统恶性克隆性疾病,是最常见的成人血液系统肿瘤。尽管化疗在AML治疗中取得良好效果,但仍有许多AML患者预后不良并复发。因此,探索新的治疗药物及方法以提高AML患者生存率非常必要。 近年来的大量研究表明,除了原癌基因与抑癌基因的基因变异可以导致肿瘤的发生,表观遗传学的改变同样与与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。目前研究最为广泛的表观修饰是CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子的甲基化状态。DNA甲基化在不改变DNA序列的情况下,对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用,并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中可以稳定传递。原癌基因及抑癌基因的DNA异常甲基化可以影响基因的Mrna和蛋白表达水平,最终导致肿瘤的发生。由于表观修饰被认为是一种可以逆转的非DNA序列改变的遗传变化,针对表观修饰的抗肿瘤药物具有良好的研发和应用前景。 地西他滨(decitabine, DAC)是目前应用最为广泛的DNA去甲基化药物,对多种恶性血液病包括骨髓增生异常综合征(MDS)、AML和慢性粒细胞自血病(CML)等均有明显疗效。DAC在体内外均能通过抑制DNA甲基转移酶使抑癌基因恢复正常的去甲基状态,重新激活那些由于DNA过度甲基化而失活的基因,使细胞恢复正常终末分化、衰老或凋亡。近年来的研究显示,DAC对不适于标准诱导缓解化疗方案的AML患者,尤其是老年患者,具有良好疗效,并且在AML各阶段均发挥作用。目前,关于DAC对AML疗效的大量临床试验正在进行中。 我们研究发现,在AML患者的骨髓标本中,SMG1(suppressor withmorphogenetic effect on genitalia family member)基因的启动子区存在高甲基化的表观遗传学改变。SMG1属于PIKK家族的一员,其主要功能是参与无义介导的Mrna降解(nonsense-mediated Mrna decay, NMD),通过消除含有不成熟截止密码子的Mma,阻止截短蛋白的累积。然而,迄今为止在人类肿瘤发生发展中SMG1的功能性突变、缺失或表达改变鲜有研究。最近有研究表明,SMG1可能作为抑癌基因在肿瘤发生发展中发挥作用。同时有研究发现在人类乳头瘤病毒阳性的头颈部鳞状细胞癌中,SMG1因其启动子区域高甲基化而导致其表达水平降低。然而,到目前为止,在AML中SMG1的启动子区域甲基化状态及其表达水平未有研究报道。 Cristina等研究发现SMG1和雷帕霉素靶蛋白复合体1(Mtorc1)在涡虫的机体损伤反应和细胞增殖调控中有着相互拮抗的作用,提示SMG1可能作为潜在的肿瘤抑癌基因而发挥作用。Mtor信号通路主要调控细胞生长和增殖,对蛋白合成起重要作用。已有多个领域的研究发现许多人类恶性疾病都存在Mtor信号通路的过度激活,参与肿瘤的发生发展。因此,许多将Mtor信号通路作为抗肿瘤作用靶点的药物正在积极研发中。同时,也有研究表明多个已知人类抑癌基因都可以抑制Mtor信号通路相关分子的表达。虽然已有报道称在AML中Mtor信号通路处于过度激活的状态,但SMG1与Mtor之间的调控关系在AML中还未有研究。 研究目的： 检测SMG1、Mtor在AML患者骨髓中的表达水平；研究SMG1表观修饰甲基化状态与SMG1、Mtor表达的关系；探讨SMG1与Mtor的相互作用机制,为DAC治疗AML提供理论依据和实验室基础。 研究方法： 1.标本采集：收集50例AML患者和32例健康志愿者的骨髓标本,采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞。 2. Real time RT-PCR实验：TRIzol方法提取细胞总RNA,使用M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为Cdna,应用Real time RT-PCR检测SMG1、Mtor基因Mrna水平在AML细胞系及患者中的表达情况。 3.DNA提取及MSP实验：DNA提取试剂盒提取单个核细胞总DNA,检测浓度与纯度后采用甲基化重硫酸盐试剂盒进行化学修饰,确定SMG1基因启动子区域,利用Methprimer设计甲基化引物,MSP法检测SMG1基因启动子区的甲基化状态。 4.去甲基化DAC处理：AML细胞种板培养24小时后,加入梯度浓度的DAC继续培养48小时,然后检测细胞凋亡及SMG1、Mtor的表达情况。 5.细胞转染：下调SMG1基因表达时,使用lipofectamine2000将针对SMG1的siRNA片段转染AML细胞,48小时后应用Real time RT-PCR和Western blot检测siRNA片段对SMG1Mrna和蛋白表达的阻断效率。 6.流式细胞术检测凋亡：DAC处理AML细胞48小时或者采用siRNA干扰阻断SMG1表达48小时后,采用Annexin V/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡。 7. Western blot实验：不同条件处理的细胞使用细胞裂解液RIPA提取细胞总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。全细胞裂解液使用SDS-PAGE进行凝胶电泳,应用Western blot法检测SMG1、Mtor、p-Mtor蛋白表达水平。 8.统计学分析：应用SPSS17.0软件,采用Mann-Whitney U检验分析AML患者组和对照组中SMG1、Mtor的表达差异,P0.05被认为差异有统计学意义。 研究结果： 1.SMG1在AML患者中表达下调： 实时RT-PCR证实,与32例健康对照者相比,SMG1在AML中表达水平更低。 2.SMG1在AML细胞系和患者中存在启动子区高甲基化： ①在Kasumi-1, HL60, THP-1, HEL四种AML细胞系中SMG1启动子区存在不同程度的高甲基化状态。 ②MSP证实50例AML患者中33例存在SMG1启动子区高甲基化(66%),而14例健康对照中均不存在SMG1启动子区高甲基化(0/14)。 3.DAC去甲基化处理影响SMG1表达： ①与对照组相比,DAC去甲基化处理可以逆转HEL细胞的SMG1启动子区高甲基化状态。 ②DAC去甲基化处理诱导HEL细胞表达SMG1,并存在剂量依赖效应。 4.DAC去甲基化处理诱导AML细胞凋亡：与对照组相比,DAC去甲基化处理使HEL细胞的早期凋亡和晚期凋亡细胞比例均有显著增加。 5.下调SMG1抑制AML细胞凋亡： 流式细胞仪检测证实SMG1-siRNA组中HEL细胞的早期凋亡和晚期凋亡细胞比例低于siRNA对照组。 6.在AML中Mtor与SMG1的表达呈负相关： ①实时RT-PCR证实,与32例健康对照者相比,Mtor在50例AML患者中表达水平更高。 ②western blot证实,与对照组相比,DAC去甲基化处理可以降低Mtor表达水平,并存在剂量依赖效应。 ③实时RT-PCR与western blot证实,在SMG1-siRNA组中Mtor的Mrna和蛋白表达水平均高于siRNA对照组。 结论： 1.AML中SMG1表达下调与其启动子区域存在高甲基化有密切关系。 2.DAC去甲基化处理通过逆转SMG1启动子区高甲基化,升高SMG1表达水平,诱导AML细胞凋亡,反之,下调SMG1抑制AML细胞凋亡。 3.SMG1通过表观遗传学的改变,与Mtor信号通路在调节细胞生长中相互拮抗,在AML中发挥抑癌基因的作用。