甲强龙对慢性淋巴细胞白血病Wnt信号通路的影响

【摘要】：慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)是一种进展缓慢的以成熟B淋巴细胞在外周血、骨髓、脾脏和淋巴结聚集为特征的恶性淋巴系统克隆增殖性疾病,骨髓的正常造血功能受到抑制,最终骨髓衰竭,病人出现贫血、出血、感染以及淋巴器官浸润肿大。CLL在欧美国家较为常见,占成人白血病的1/3,我国发病率明显低于西方国家,但近年来随着人口老龄化,CLL发病率有逐年增加趋势。 CLL因细胞和分子遗传学不同,常呈现不同的药物敏感性,生存期从数月到十余年不等,疾病预后差异很大。随着嘌呤类似物及新兴单克隆抗体等在临床的广泛应用,CLL的一线治疗取得很大进展,使CLL的总生存率、治疗客观缓解率、完全缓解、无疾病进展生存期,甚至分子学缓解率均大大提高。但是,CLL依然是一种无法治愈的恶性血液疾病,部分患者复发、对化疗耐药,尤其是伴有del(17p)或P53突变等不良预后因素的患者复发/难治情况更为常见。异基因造血干细胞移植被认为是可能治愈CLL的唯一手段,但由于CLL主要为老年患者,仅有少数年轻且有HLA相合供者的患者才有机会移植。因此,对于复发／难治的CLL患者,迫切需要寻找新的、安全、有效的治疗方法。 近几年的临床研究发现,BTK抑制剂、P13K抑制剂、Bcl-2抑制剂、新的抗CD20单抗(Obinutuzumab)以及阿伦单抗联合大剂量激素等在CLL中的应用中均取得了非常满意的治疗效果,且可能不受P53突变、del(llq)等不良预后因素的影响。根据我们目前国情,大剂量糖皮质激素是一个很好的治疗选择。大剂量糖皮质激素用于CLL中的治疗已有近20年的历史,无论单药或与其他单克隆抗体联合治疗,均获得了满意的临床效果。 近年来随着糖皮质激素分子作用机制的研究进展,已经明确糖皮质激素可通过基因组效应和非基因组效应两种途径发挥作用。据报道,大剂量糖皮质激素治疗CLL的作用机制可能涉及抑制bcl-2、c-myc、cyclin-D3mCaspase多级蛋白酶体的激活,下调酪氨酸激酶LYN、SYK,以及诱导自噬等多个方面,尤其重要的是,大剂量糖皮质激素可不依赖P53信号途径对伴有del (17p)或P53突变的难治CLL患者产生治疗作用,但关于糖皮质激素诱导CLL细胞凋亡的具体机制,尤其是对异常信号通路的影响尚不清楚。 多项研究表明,异常激活的Wnt信号通路在CLL的发病机制中占有重要地位,通过抑制Wnt信号通路可以减低CLL细胞的生存活性,而淋巴增强因子-1(lymphoid enhancing factor1, LEF-1)作为Wnt信号通路的终末转录因子,在CLL细胞中过表达最为显著,已被看作是CLL治疗非常有价值的一个潜在靶点。 目的： 通过观察不同浓度甲强龙对CLL细胞的增殖/凋亡以及对Wnt信号通路关键蛋白／基因(β-catenin. LEF-1)表达的影响,以探讨糖皮质激素在CLL治疗中的作用机制,更好的为CLL治疗提供依据。 方法： 人CLL来源的MEC-1细胞株体外培养,分别给予不同浓度的甲强龙进行处理,选择不同时间点CCK8(Cell Counting Kit8)法检测细胞增殖,TUNEL (terminal dexynucleotidyl transferase(TdT) mediated dUTP nick end labeling)实验检测细胞凋亡,蛋白印记分析(Western blot)检测凋亡蛋白Active-caspase3和Wnt信号通路中关键蛋白分子β-catenin、LEF-1,荧光定量法(RT-PCR)检测基因β-catenin、LEF-1、c-myc和cyclin D1的mRNA表达水平。 结果： 1、甲强龙抑制MEC-1细胞株的细胞增殖：MEC-1细胞给予不同浓度的甲强龙进行处理(0、1uM、50uM、100uM、500uM),分别于0h、12h、24h、48h、72h、96h CCK8法检测细胞增殖结果显示：甲强龙浓度为1uM和10uM时,MEC-1细胞增殖活力无明显下降,当浓度大于50uM时(50uM、100uM、500uM), MEC-1细胞增殖活性受到明显的抑制,该抑制作用大约从24小时开始显现(抑制作用分别为23.34%、30.73%、30.57%),48小时变为明显(抑制作用为28.48%、42.35%、44.56%),并且随甲强龙浓度的增加和作用时间的延长,对MEC-1细胞增殖的抑制作用逐渐增强。 2、甲强龙上调Active-caspase3的表达,诱导细胞凋亡：我们根据细胞增殖实验的趋势选择三个浓度(10uM、50uM和100uM)的甲强龙进行处理,分别于Oh、12h、24h、48h检测Active-caspase3的表达情况,Western blot结果显示：甲强龙浓度大于50uM时,从24h开始Active-caspase3的相对表达量显著增加,说明高浓度的甲强龙可诱导明显的细胞凋亡,而低浓度的甲强龙(10uM)不能诱导细胞凋亡。我们选择甲强龙浓度100uM处理细胞继续行TUNEL实验发现,从24h开始,MEC-1细胞出现了经典的TUNEL染色阳性,且程度随时间延长而加深,进一步证实细胞凋亡的出现。 3、甲强龙抑制Wnt信号通路中关键蛋白LEF-1及其下游基因c-myc和cyclin D1的表达：我们选择终浓度为100uM的甲强龙进行处理细胞,分别于0h、24h、48h检测Wnt信号通路中β-catenin和LEF-1的表达水平,Western blot结果显示：β-catenin的表达在甲强龙处理过程中无明显改变,其相对表达量分别为1.46+0.22、1.17±0.10、1.17±0.15(P=0.1248)；而LEF-1的表达水平随着时间的延长而下降,其相对表达量分别为1.44±0.21、0.984±0.09、0.88±0.04(P=0.0044),24h和48h的表达水平较甲强龙处理前分别下降31.94%、38.89%。RT-PCR技术检测β-catenin、LEF-1、c-myc和cyclin Dl的mRNA表达水平发现,β-catenin和LEF-1mRNA的表达在甲强龙处理过程中无明显改变,而c-myc和cyclinD1的mRNA在此过程中表达下降。 结论： 1、高浓度的甲强龙明显抑制慢性淋巴细胞白血病的细胞增殖,促进凋亡蛋白Caspase-3的激活,Active-caspase3表达升高,诱导细胞凋亡的出现。 2、甲强龙对慢性淋巴细胞白血病Wnt信号通路中β-catenin和LEF-1的mRNA转录水平无影响,可能通过影响蛋白翻译或翻译后水平的调控下调LEF-1蛋白,进而抑制其下游基因c-myc和cyclinD1的表达,促进细胞凋亡的发生。 3、甲强龙通过下调Wnt信号通路中的LEF-1蛋白而抑制Wnt信号通路,诱导细胞凋亡,为大剂量甲强龙治疗难治性慢性淋巴细胞白血病的机制研究提供新的理论依据。