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IL-6对TGF-β1/Smad3信号通路介导缺血心肌重构的影响及作用机制

王加红  
【摘要】:[研究背景和目的]冠心病是严重危害人类健康的主要疾病之一。由于心肌缺血、缺氧导致心肌损伤、坏死和修复,引起心室重构(ventricular remodeling, VR),心肌纤维化是其主要病理特点之一,由于组织纤维化是不可逆转的组织结构性病理改变,因此深入了解心肌组织纤维化发生、发展的机制就显得尤为重要。研究表明,心肌缺血缺氧时白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)释放增加;IL-6在心肌缺血再灌注损伤的心功能障碍中起重要作用;IL-6可能是导致器官纤维化的重要因素。转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)可通过Smads依赖通路在多种疾病的纤维化重构中起多重调整作用。心肌缺血或梗死时,TGF-β1信号可诱导心肌纤维母细胞成纤维化,促进胶原蛋白和纤维连接蛋白合成,从而促进心肌组织的纤维化过程。IL-6可介导TGF-β1信号途径调控多种疾病的纤维化重构过程。然而,IL-6/TGF-β1是怎样影响缺血心肌重构却少有相关研究报道。为此,本研究首先通过临床观察研究,分析缺血性心脏病行狭窄冠脉血管完全再血管化、不完全再血管化和单纯药物治疗后6个月、12个月心功能、心脏重构指标和心肌缺血程度的变化,观察各时间点血清IL-6的动态变化,并分析IL-6的动态变化与心功能改变和心脏重构指标改变的相关性;为进一步探讨IL-6对TGF-β1信号路径在心肌重构中的调节作用及机制,通过结扎大鼠左前降支血管建立心肌缺血模型,观察外源性1L-6刺激或抑制后心肌炎症反应、纤维化情况及IL-6、TGF-β1、Smad3信号分子表达情况,分析这些指标变化对梗死动物心脏结构重构和心功能的影响;由于心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)是导致梗死心肌重构以及心脏修复的关键因素,故进一步利用缺氧培养CFs模型,观察外源性IL-6刺激或抑制对CFs凋亡及增殖的影响,检测相关炎症因子和心肌纤维化指标变化情况,目的旨在探究IL-6对TGFβ1/Smad3信号通路介导心肌成纤维化的影响及作用机制,为改善心肌重构保护心功能提供新的治疗思路。[研究方法]临床部分:入选多家心血管住院的缺血性心脏病伴严重心衰的患者66例,按指南及患者意愿接受完全再血管化(CR)+标准药物治疗(D)、不完全再血管化(IR)+标准药物治疗(D)和单纯标准药物治疗(D)三种治疗方式,并分为3组,CRD组(n=14)、IRD组(n=34)和D组(n=18)。随防观察治疗后6个月和12个月,患者心功能和心脏重构指标的变化,同时观察各时间点血清IL-6的动态变化,并分析IL-6的动态变化与心功能改变和心脏重构指标改变的相关性。动物实验部分:通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立大鼠心肌缺血模型,随机对动物进行IL-6或IL-6受体抑制剂干预,并将动物分为冠脉结扎(Ligation, LI)+生理盐水(NS)组(LINS组);冠脉结扎(LI)+IL-6 (IL)组(LIIL组)和冠脉结扎(LI)+IL-6受体抑制剂(LIR)组(LIILR组),同时设立假结扎组(SHAM组)为对照组。将IL-6及IL-6受体抑制剂(Tocilizumb)于心肌梗死模型制备即刻4个点注射到各组动物梗死心肌及周边。建模后1w、2w分别对各组大鼠进行超声心动图检查,测量大鼠左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)。术后2周处死大鼠,心脏经石蜡包埋制成石蜡切片。切片进行HE染色,显微镜观察病理变化和梗死面积;Masson染色评估梗死边缘区纤维化程度,检测心肌胶原沉积情况和心肌结构的变化;免疫组织化学法检测心肌组织IL-6和TGF-β1表达。梗死组织均浆的上清液用ELISA方法行炎症指标MPO、IL-6,氧化应激指标ROS及纤维化指标TGF-β1、MMP2、MMP9等细胞因子的测定。细胞实验部分:从新生大鼠的心脏分离培养心肌成纤维细胞(CFs),通过Vimentin免疫荧光检测鉴定所分离培养的细胞为CFs,建立心肌成纤维细胞缺氧培养模型(培养条件:37℃,5% C02,2.5%O2)。随机分为四组:CFs常氧培养组(培养条件:37℃,5% CO2,20%O2);缺氧培养CFs组(H-CFs);缺氧培养CFs+IL-6受体抑制剂组(H-CFs+antiIL-6r);缺氧培养CFs+IL-6组(H-CFs+IL-6).用CCK-8试剂盒检测上述各组细胞培养0、24h、48h、72h的增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Realtime-PCR、Western blot等技术观察各组细胞中IL-6、TGF-β1、Smad3、MMP2/9等信号分子]mRNA和蛋白水平表达情况。[研究结果]临床部分:各组随心肌缺血程度不同,其生存率明显不同,完全血运重建组(CRD组)为94%,不完全血运重建组(IRD组)为91%,单纯药物治疗组(D组)为86%。CRD组和IRD组术后6月较入院时NYHA心功能分级从术前Ⅲ~Ⅳ级改善为Ⅱ-Ⅲ级,左室射血分数(LVEF)较术前升高(P0.01),心功能改善程度均好于D组(P0.01),术后12个月进一步改善,但IRD改善程度不如CRD组。心衰定量标志物血清生化指标NT-proBNP变化与心功能结果相一致,三组入院治疗后,NT-proBNP随心功能改善而降低,CRD组6个月时下降最明显,IRD组次之,D组下降幅度最小(均P0.01),各组12个月时较6个月比较无统计学意义(P0.05)。室壁运动积分指数WMSI,在D组入院与6个月、12个月随访时比较无统计学意义。CRD组术后6个月WMSI明显降低(P0.01),并持续到12个月(P0.01)。IRD组术后6月时WMSI较入院时有明显降低(P0.05),但与术后12个月比较无,明显差异(P0.05)。心脏结构指标(LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV) PCI组术后6个月、12个月均较PCI前显著缩小(P0.01),CRD组改善更明显,优于IRD组(P0.01),而D组随访6个月LVEDD、LVEDV虽较入院时有所缩小(P0.01),但12个月随访时未出现继续改善现象(P0.05)。血清学检测显示,炎症指标IL-6和心肌坏死指标hs-cTnT各组入院时均明显高于正常值,CRD组手术后6个月时下降至正常值(P0.01),延续到12月;IRD组IL-6和hs-cTnT6个月较入院时也有明显下降(P0.01),但术后12个月略高出正常值;D组IL6和hs-cTnT在正规药物治疗后有降低趋势,与治疗后6月和12月无明显差异(P0.05)。相关分析显示,CRD组IL-6的变化值与心功能指标变化值HYHA和NT-proBNP呈明显正相关(各相关系数为0.6614,和0.8356),与LVEF变化值呈明显负相关(-0.7604);与心脏重构指标呈明显正相关(LVEDD0.8335, LVESD0.7987,LVEDV0.8323, LVESV0.8365);与心肌坏死指标hs-cTnT呈明显正相关(0.8856);与室壁运动积分指数WMSI呈明显正相关(0.8393)。动物部分:成功建模后的大鼠术后生存率比较:LIILR组生存率为90%,明显高于其它两组(LINS组65%,LIIL组50%,均p0.01)。术后1w、2w分别行心脏超声,结果显示,心肌梗死动物的LVEF和LVFS呈进行性下降,LVEDD和LVESD呈进行性扩张,与SHAM组相比LINS组心功能明显下降,LIIL组心功能最差,而LIILR组高于LINS和LIIL组(均P0.05)。建模后2w心肌组织切片HE染色观察发现LINS、LIIL、LIILR三组较SHAM组炎症反应明显,LIIL炎症反应最严重,LIILR则较LINS组和LIIL组明显减弱。组织匀浆中的MPO、ROS水平与HE染色的镜下炎症改变程度一致。Masson染色显示,相比于SHAM组,LINS组大鼠梗死边缘区心肌细胞排列紊乱,间质内蓝色胶原纤维增多,分割心肌束,一些胶原纤维出现融合,心肌纤维化程度增加。LIIL组心肌组织中蓝绿的胶原纤维更多,胶原沉积明显增加,加入IL-6受体抑制剂则抑制了LIILR组胶原生成。梗死组织匀浆中IL-6、TGF-β1、MMP2/9水平都明显高于SHAM组,LIIL组最高,而LIILR组则明显低于LINS组和LIIL组(P0.05)。免疫组化显示LINS组、LIIL组、LIILR组中均有IL-6和TGF-β1表达,染色半定量分析,提示LIIL组相比于LINS组IL-6和TGF-β1表达更多,LIILR则明显低于LINS组和LIIL组(P0.05)。细胞部分:成功分离得到原代乳鼠心肌成纤维细胞,CFs镜下呈现梭形,用Vimentin免疫荧光检测加以鉴定。CFs组在培养24h、48h和72h后细胞密度呈进行增加(P0.05), H-CFs组细胞增殖明显降低,加入IL-6后进一步降低CFs增殖,使CFs在培养后各点无显著性差异,加入IL-6受体抑制剂后则显著增加细胞增殖,使H-CFs+anti-IL-6r组细胞增殖率在培养24h、48h和72h后明显高于H-CFs组和H-CFs+IL-6组(P0.05)。流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,CFs组细胞凋亡率仅为0.2%左右,而行缺氧培养后细胞凋亡率明显增加,加IL-6后凋亡进一步增加,给予anti-IL-6r后可明显抑制细胞凋亡(P0.05)。各组的细胞匀浆行RT-PCR和WB方法检测,与CFs组相比,H-CFs组、H-CFs+IL-6组、H-CFs+antiIL-6r组三组IL-6、TGF-β1、Smad3、MMP2、MMP9细胞因子的mRNA和蛋白表达量均增加,H-CFs+IL-6组表达量最高,而加IL-6受体抑制剂组则明显降低上述因子的表达(P0.05)。[研究结论]1.临床上缺血心脏的心功能和重构指标随着冠脉介入后的心肌缺血程度改善而改善,血清IL-6水平也随之改善,而且IL-6变化与心脏功能和重构指标改变呈明显相关。2.IL-6可促进梗死心肌的炎症反应,使胶原合成与分泌增加促进组织纤维化,是左室重构的重要调控信号分子。3.IL-6对心室重构的促进作用可能是由IL6/TGF-β1/Smad3/mmp2/mmp9信号转导通路介导的。


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