Rac1信号通路在滋养细胞侵袭行为中的作用及机制研究

【摘要】：第一部分Rac 1信号通路在正常妊娠及子痫前期中表达的研究研究目的检测Rac1信号通路在正常妊娠及子痫前期产妇胎盘的表达变化,探讨其与滋养细胞侵袭的关系。研究方法从2010年6月至2014年12月,我们在山东大学第二医院收集的就诊孕妇,其中,正常妊娠组共50例,分为早孕组及足月妊娠组,早孕组为25例6-9周妊娠者,行人工流产术,年龄(28.5±3.8)岁；足月妊娠组为25例37-40周妊娠者,行择期剖宫产术,年龄(27.9±3.3)岁；子痫前期组共计67例行择期剖宫产的37-40周子痫前期患者,其中子痫前期轻度组37例,年龄(28.9±3.25)岁；子痫前期重度组30例,年龄(26.9±2.8)岁。各组孕妇的孕周、年龄、孕次以及基础血压等无明显差异性(P0.05)。分别采用Real-time PCR法、免疫组织化学法、GTPase pull down、Western blot法检测50例正常妊娠组(包括早孕25例、足月妊娠25例)以及67例子痫前期组(包括子痫前期轻度37例、子痫前期重度30例)胎盘组织GTP-Rac1、Rac1与其下游的靶基因β-catenin、 Snail的蛋白表达及MMP9的蛋白定位、表达和mRNA的变化。结果我们应用GTPase pull down以及Western blot法对正常妊娠组以及子痫前期组胎盘组织GTP-Rac1的表达水平进行检测,结果显示早孕组胎盘绒毛组织中GTP-Rac1的表达水平显著高于足月妊娠组(P0.05)；子痫前期组GTP-Rac1的表达水平明显低于足月妊娠组(P0.05),其中,子痫前期重度组GTP-Rac1表达水平低于子痫前期轻度组,差异有统计学意义(P0.05)；而各组间Rac1蛋白表达水平未见明显的差异(P0.05)。Western blot检测发现,早孕组胎盘组织核内β-catenin及Snail表达水平显著高于足月妊娠组(P0.05)；子痫前期组胎盘组织核内β-catenin及Snail表达水平低于足月妊娠组,差异有统计学意义(P0.05),其中子痫前期重度组的β-catenin及Snail表达水平显著低于子痫前期轻度组(P0.05)。免疫组化结果显示,MMP9主要在细胞滋养细胞、合体滋养细胞中表达,可见其主要分布于胞浆,呈棕黄色或深棕黄色,足月妊娠组较早孕组MMP9阳性细胞数量明显减少；子痫前期组MMP9阳性细胞数量明显低于足月妊娠组,且染色明显减弱,子痫前期重度组与子痫前期轻度组比较,MMP9阳性细胞数量明显降低,染色明显减弱。Western blot及Real-time PCR结果示,早孕组MMP9蛋白及mRNA的表达水平明显高于足月妊娠组(P0.05)；子痫前期组胎盘组织的MMP9蛋白及mRNA的表达水平显著低于足月妊娠组(P0.05),且子痫前期重度组与子痫前期轻度组比较,胎盘组织中MMP9蛋白及mRNA的表达水平显著降低(P0.05)。结论(1) GTP-Rac1在正常妊娠胎盘滋养细胞中的表达随孕周增加而降低,且Rac1下游重要的靶基因β-catenin Snail在胎盘组织核内的表达及与滋养细胞侵袭力密切相关的MMP9的表达与Rac1的活性变化一致。Rac1信号通路的变化与正常早期妊娠滋养细胞侵袭能力最强,而至晚期妊娠几乎无侵袭能力的变化相同,这提示了Rac1信号通路可能通过对MMP9表达的调控,参与了滋养细胞侵袭的调控。(2)子痫前期组与足月妊娠组比较,胎盘组织中GTP-Rac1及MMP9的表达与核内β-catenin以及Snail的表达明显降低,且在子痫前期重度组中,其表达水平最低,这提示Rac1信号通路可能通过调控MMP9的表达在子痫前期胎盘滋养细胞浅侵袭的病理过程中发挥关键作用。第二部分Racl信号通路对绒毛外滋养细胞侵袭行为的影响研究目的探讨Rac1信号通路对体外培养人绒毛外滋养细胞系HTR-8/SVneo由MMP9的活化以及细胞侵袭力的影响。研究方法体外培养人绒毛外滋养细胞系,使用脂质体将重组质粒Rac1 shRNA转染HTR-8/SVneo细胞,检测]Rac1 shRNA对HTR-8/SVneo细胞中Rac1表达的抑制作用。将HTR-8/SVneo细胞分为：正常对照组(normal control,只加脂质体)、Cont-shRNA组f转染重组质粒Cont-shRNA), Rac1 shRNA组(转染重组质粒Rac1 shRNA)及β-catenin阻断组(给予β-catenin阻断剂IWP-2)。根据Invitrogen提供的试剂盒说明书选择优化转染条件,稳定转染HTR-8/SVneo细胞。应用Western blot法检测Rac1的活化及表达水平变化；Western blot法测定HTR-8/SVneo细胞β-catenin及Snail的蛋白表达变化；细胞免疫荧光法检测MMP9的表达；Transwell invasion实验检测HTR-8/SVneo细胞侵袭力变化；Real-time PCR法检测Rac1mRNA和MMP9 mRNA的表达。结果Western blot法检测显示,shRNA-Rac1重组质粒能够成功在HTR-8/SVneo细胞表达,并能抑制Rac1基因的表达。Western blot检测发现,正常对照组及Cont-shRNA组HTR-8/SVneo细胞核内表达β-catenin、Snail,而Rac1 shRNA组与β-catenin阻断组的细胞核内表达的β-catenin、Snail水平明显比正常对照组低(P0.05)。细胞免疫荧光结果示,MMP9在正常对照组及Cont-shRNA组的HTR-8/SVneo细胞内染色明显,而在Rac1 shRNA组及β-catenin阻断组,染色明显减弱。Western blot及Real-time PCR结果进一步证实,shRNA-Rac1能显著抑制HTR-8/SVneo细胞MMP9蛋白及mRNA的表达(P0.05)；Transwell invasion实验结果显示：正常对照组与Cont-shRNA组的穿透细胞数目无明显差异(P0.05)；Rac1 shRNA组以及β-catenin阻断组的穿透细胞数目显著低于正常对照组(P0.05)。结论在HTR-8/SVneo细胞中,Rac1可能通过诱导β-catenin核内表达而使Snail活化,并明显增加HTR-8/SVneo细胞中MMP9表达,从而调控绒毛外滋养细胞的侵袭行为。