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天麻素改善亚氨基二丙腈诱导记忆障碍及脂多糖诱导炎症对学习记忆影响研究

王潇娜  
【摘要】:背景腈类化合物是一种化学溶剂,是合成纤维(尼龙)、塑料、染料和药剂等的中间产物,广泛用于制造业。腈类化合物通过皮肤被人体吸收,其职业和环境暴露与人类健康息息相关。亚氨基二丙腈(3,3'-iminodipropionitrile, IDPN)是普遍应用的人工合成有机腈类化合物。研究表明,IDPN的神经毒性可诱发神经行为异常,特征是重复性头部运动、旋转、后退和活动过度;其运动障碍与不同脑区的多巴胺、5-羟色胺系统功能失调和氧化应激有关。IDPN诱导的运动障碍在啮齿类动物的症状,可模拟伴有认知功能障碍的抽动-秽语综合征和亨廷顿病的运动失调。此外,IDPN也引起大脑结构和神经功能障碍,如IDPN引起海马结构变化、胶质纤维增生、中间神经元减少和抑制轴突可塑性。重要的是IDPN可引起啮齿类动物T迷宫学习、空间记忆和被动回避记忆障碍。因此,IDPN诱导的动物模型对阐明神经系统疾病的认知障碍的神经生物学机制,并对研发有效的药物提供理论依据。天麻素是传统中药天麻的主要生物活性成分,用于治疗神经系统疾病。其具有多种药理学效应,包括抗炎、抗焦虑、抗抑郁和神经保护功能。天麻素也具有增强认知的效应,如天麻素可减轻老年痴呆模型小鼠水迷宫的记忆障碍和逆转铅诱导大鼠海马受损的突触可塑性。此外,天麻素具有抗氧化的特性,可降低脂质过氧化物和提高抗氧化蛋白表达。天麻素通过降低细胞活性氧和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,提高线粒体跨膜电位和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,从而抑制谷氨酸诱导的氧化应激。但天麻素能否改善IDPN诱导的记忆障碍及其机制,尚未见报道。目的本研究从认知行为学、多巴胺系统、5-羟色胺系统和氧化应激四个方面,探讨天麻素是否改善IDPN诱导的记忆障碍。方法将Wistar大鼠随机分为生理盐水对照、天麻素对照、IDPN和天麻素处理四组。IDPN和天麻素处理组大鼠,腹膜腔注射IDPN,连续7天,建立IDPN模型。同时,生理盐水对照和天麻素对照组大鼠,腹膜腔注射生理盐水,连续7天。第8天,天麻素对照和天麻素处理组大鼠,灌胃天麻素,连续8周。同时,生理盐水对照和IDPN组大鼠,灌胃生理盐水,连续8周。最后一次药物注射后60 min,首先观察天麻素对IDPN诱导的大鼠Y迷宫空间记忆和新奇物体识别记忆的影响;进一步运用高效液相色谱-电化学方法,检测海马组织多巴胺(dopamine, DA)、5-羟色胺(serotonin,5-HT)及代谢产物的含量;免疫印迹检测海马多巴胺D2受体(D2 receptor, D2R)和多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)、5-HT1A受体(5-HT1A receptor,5-HT1AR)和5-HT转运体(serotonin transporter, SERT)蛋白表达;并采用化学比色法检测海马超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)含量的变化。结果1.Y迷宫实验结果显示,与生理盐水组相比,IDPN组大鼠自发交替轮转率显著降低;与IDPN组相比,天麻素处理组大鼠自发交替轮转率显著增加。与生理盐水组相比,IDPN组大鼠进入三个臂的总次数显著增多;与IDPN组相比,天麻素处理组大鼠进入三个臂的总次数显著降低。此外,新奇物体识别实验结果显示,在训练期,四组大鼠探索两个物体时间无统计学差异。在测试期,与生理盐水组相比,IDPN组大鼠对新奇物体探索时间和辨别指数显著降低;与IDPN组相比,天麻素处理组大鼠对新奇物体探索时间和辨别指数显著增加。2.高效液相色谱结果表明,与生理盐水组比较,IDPN组大鼠海马DA及代谢产物高香草酸(homovanillic acid, HVA)含量显著降低;而天麻素处理组与IDPN组相比,DA和HVA显著增高。此外,与生理盐水组相比,IDPN组大鼠海马5-HT含量显著降低;与IDPN组相比,天麻素处理组5-HT水平显著增高。各组大鼠海马5-HT代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HTIAA)无显著性差异。3.免疫印迹结果显示,与生理盐水组比较,IDPN组大鼠海马D2R和SERT表达显著增高;而天麻素处理组与IDPN组相比,D2R和SERT表达显著降低。与生理盐水组比较,IDPN组大鼠海马5-HT1AR与DAT表达显著降低;而天麻素处理组与IDPN组相比,5-HT1AR与DAT表达显著增高。4.化学比色法结果表明,与生理盐水组相比,IDPN组大鼠海马SOD活性显著降低;天麻素处理组可逆转IDPN组SOD活性的降低。此外,IDPN组大鼠MDA含量较生理盐水组增高;天麻素处理组MDA含量较IDPN组显著降低。四组大鼠海马GSH-Px活性无显著性差异。结论1.IDPN引起大鼠空间记忆和新奇物体识别记忆障碍。2. IDPN降低海马DA和HVA水平,降低DAT表达,并提高D2R表达;而天麻素使IDPN引起的DA和HVA水平回升,逆转DAT和D2R蛋白的表达,这表明天麻素可能通过稳定DA系统,改善IDPN诱导的记忆障碍。3. IDPN降低海马5-HT水平,降低5-HT1AR表达,并提高SERT表达;而天麻素使IDPN引起的5-HT水平回升,逆转5-HT1AR和SERT蛋白的表达,这表明天麻素也可能通过稳定5-HT系统,改善IDPN诱导的记忆障碍。4. IDPN降低海马SOD活性和增加MDA水平;而天麻素使IDPN引起的SOD活性增高和MDA水平降低,这表明提高抗氧化和减轻脂质过氧化功能,可能是天麻素改善IDPN诱导的记忆障碍作用机制之一。背景炎症是老年痴呆、癌症、糖尿病、肥胖、急性肺损伤、关节炎和炎症性肠病等疾病的关键性病理因素,炎症对脑认知功能影响已逐渐成为研究焦点。细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分,是引起感染性炎症损伤主要的病原菌之一;腹膜腔注射LPS诱导机体产生炎症反应。LPS通过激活Toll样受体4,促进细胞因子释放和细胞凋亡,进而抑制海马依赖性的学习和记忆。腹膜腔注射LPS可降低Morris水迷宫空间学习的获得和条件性恐惧记忆的巩固。但有学者报道,LPS具有促进空间学习和记忆的能力。到目前为止,感染性炎症对脑认知功能的影响及其机制尚不明确。表观遗传学的迅猛发展为深入研究LPS对认知功能的影响带来了曙光。DNA甲基化是最主要的表观遗传修饰,通过改变染色质构象,抑制基因表达。甲基化修饰参与LPS诱导的炎症反应。肠上皮细胞DNA甲基化使Toll样受体4表达减少,从而抑制LPS诱导的炎症反应。脾细胞DNA甲基化参与LPS诱导的IgM反应,LPS也显著降低大鼠肝组织DNA甲基化水平。此外,越来越多证据表明,DNA甲基化参与学习和记忆的调节。DNA甲基化调节基因的表达,这对于线索性恐惧记忆的巩固和再巩固极其重要。条件性恐惧记忆使小鼠抑制记忆的蛋白磷酸酶1基因启动子的CpG岛甲基化水平增加,而促进记忆形成的reelin基因启动子CpG岛甲基化水平降低。这些研究证实脑内特定基因的甲基化和去甲基化在学习、记忆形成和行为可塑性中具有重要作用。本研究中,内核基质蛋白(Matrin-3),含有RNA识别基序,并结合RNA,具有多种生理和病理功能。Matrin-3参与染色质重组,DNA复制/修复,翻译和调节RNA转运;Matrin-3通过磷酸化的蛋白激酶A (PKA),激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体,进而调节神经元死亡。重要的是NMDA受体诱导,PKA调节的Matrin-3磷酸化和细胞核基质,协同调节长时程增强。Matrin-3与TDP-43相互作用,引起家族性肌萎缩硬化症和额颞痴呆。此外,APP/PS1转基因老年性痴呆模型小鼠海马细胞外基质表达上调,可抑制条件性恐惧记忆与长时程记忆。重要的是本实验蛋白组学研究表明,LPS使海马Matrin-3表达增高,但Matrin-3是否参与LPS诱导的炎症引起的认知障碍,尚未见报道。因此,本研究将为临床疾病治疗,同时给予抗炎药物,保护中枢神经系统提供理论依据。目的探讨全基因组DNA甲基化修饰、蛋白组学筛选出的差异蛋白Matrin-3和Matrin-3基因启动子CpG岛甲基化修饰,是否介导LPS诱导的炎症引起认知障碍。方法将KM小鼠随机分为LPS和生理盐水两组,连续4天分别腹膜腔注射LPS和生理盐水。最后一次药物注射后2h,首先运用新奇物体识别实验和Morris水迷宫,检测LPS对小鼠学习和记忆能力的影响;利用液质色谱-串联质谱联用技术,检测炎症对小鼠海马全基因DNA的甲基化的影响;利用蛋白组学技术研究炎症引起的小鼠海马蛋白组轮廓改变,并找到可能与认知相关的差异表达蛋白质和生物学通路;进一步运用Western Blot验证蛋白组学筛选出的海马差异蛋白Matrin-3表达;荧光定量PCR检测Matrin-3 mRNA表达;采用亚硫酸氢盐测序法,检测LPS诱导的炎症海马Matrin-3基因启动子CpG岛甲基化率。结果1.新奇物体识别实验结果显示,与生理盐水组相比,LPS组小鼠新奇物体识别指数降低。此外,Morris水迷宫(训练期)结果显示,与生理盐水组相比,LPS组小鼠潜伏期显著延长;在第5天的空间探索实验中,LPS组小鼠穿过平台的次数显著减少;但两组小鼠的目标象限路程百分比无显著性差异。2.液相色谱-串联质谱结果显示,与生理盐水组相比,LPS使小鼠海马全基因组DNA甲基化率有降低趋势,但无显著性差异。。3.蛋白组学结果显示:LPS与生理盐水组共鉴定到463个重叠的蛋白质。16个蛋白质呈现显著性差异;9个蛋白质表达下调,7个蛋白质表达上调。其中,Matrin-3蛋白质表达显著上调。按照PANTHER (Protein annotation through evolutionary relationships)数据库中各蛋白质GO注释分别进行细胞成分、生物学过程及分子功能分类。结果发现,差异表达蛋白质主要来自细胞成分、大分子复合体、细胞器和细胞膜。差异蛋白质涉及的生物学过程以代谢过程、细胞过程、生物学调节和定位为主;涉及的分子功能以结合、催化活性和酶调节活性。PANTHER通路分析发现,差异蛋白质涉及的生物学通路主要是表皮生长因子受体受体信号通路、成纤维细胞生长因子信号通路、细胞因子和趋化因子信号通路调节炎症反应和帕金森症。4. Western Blot结果显示,与生理盐水组相比,LPS诱导的炎症使小鼠海马差异蛋白Matrin-3表达显著增高。此外,荧光定量PCR结果显示,与生理盐水组相比,LPS使海马Matrin-3 mRNA表达显著增高。5.亚硫酸氢盐测序结果显示,与生理盐水组相比,LPS使小鼠Matrin-3基因启动子甲基化率显著降低,并使海马Matrin-3启动子第28个CpG位点的甲基化率显著降低。结论1.LPS诱导的炎症,降低小鼠新奇物体识别记忆和空间记忆。2.LPS诱导的炎症,不影响海马全基因组DNA甲基化水平。3.LPS诱导的炎症,对海马蛋白质组轮廓产生显著影响,并提高海马差异蛋白Matrin-3与Matrin-3 mRNA表达。4.LPS诱导的炎症,降低海马Matrin-3基因启动子及其特定CpG位点甲基化率。上述结果表明,Matrin-3高表达及其低甲基化修饰,可能介导LPS诱导炎症引起的认知功能障碍。


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