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辛伐他汀通过PI3K/AKT/miR-9通路促进BMSCs的归巢

邴卫东  
【摘要】:研究背景:冠状动脉旁路移植术是严重冠心病最有效的治疗手段,术后静脉桥血管狭窄闭塞严重影响该手术的治疗效果,内皮细胞损伤以及功能障碍,是静脉桥再狭窄的始动环节。修复损伤内皮可有效抑制新生内膜的形成,对缓解再狭窄具有重要意义。研究表明骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)可直接分化为内皮细胞,促进损伤血管内皮修复,抑制新生内膜的形成,进而达到防治桥血管再狭窄的目的。移植的骨髓间充质干细胞能够有效的归巢是其发挥组织修复功能的前提,基质细胞衍生因子-1α (SDF-1α)及其受体趋化因子受体(CXCR4)在骨髓间充质干细胞的归巢中起非常重要的作用。作为SDF-1α受体,CXCR4对多种细胞的归巢过程来说是不可或缺的,BMSCs表面有CXCR4的表达,可以沿着病变部位所造成的SDF-1α浓度梯度定向迁移,最终迁移到需修复的组织。然而,体外培养传代数代后细胞表面CXCR4表达下调,导致其归巢能力下降。这影响了细胞治疗的疗效,严重影响干细胞移植在临床上的应用。因此,上调间充质干细胞CXCR4表达可以促进其定向迁移至损伤组织、器官如桥血管,进而提高BMSCs的治疗作用。辛伐他汀是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶的小分子抑制剂,可以抑制胆固醇的内源性合成进而降低血清内胆固醇水平,因而被广泛应用于与动脉血管粥样硬化相关的疾病,如冠状动脉粥样硬化性心脏病。除了降胆固醇之外,辛伐他汀还有许多其他的优点,比如抗炎症、抗氧化、免疫调节、保护内皮细胞功能等,辛伐他汀可以预防体外循环所引发的脑血管损伤及认知障碍,保护足细胞进而改善糖尿病大鼠肾功能。对BMSCs来说,辛伐他汀也有很多有利于其临床应用的作用,比如辛伐他汀可以促进BMSCs向内皮细胞分化,促进BMSCs的成骨分化等,联合应用辛伐他汀可促进BMSCs移植对提高血栓栓塞性脑中风的治疗效果。辛伐他汀还可以促进BMSCs的迁移,在骨质缺损部位局部应用辛伐他汀可以增加缺损区域骨形态发生蛋白2以及低氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达进而促进BMSCs向缺损区域聚集。那么,辛伐他汀能否通过调节CXCR4表达而影响BMSCs归巢能力?BMSCs可直接分化为内皮细胞,对桥血管的再狭窄具有防治作用,如果辛伐他汀能够提高该细胞CXCR4表达,那么联合应用辛伐他汀可否提高干细胞对桥血管狭窄的防治作用,这一问题值得进一步研究。PI3K/AKT信号通路因其能调节细胞骨架,影响细胞的迁移而得到广泛关注,它还可以调节细胞的增殖、凋亡、分化等多个方面的活性。P13K能被生长因子、药物、激素、培养环境等多种理化因素活化,作为这一通路中起关键作用的酶,PI3K活化后可以将4,5-二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化成为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇,后者可以结合AKT和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1),允许PDK1磷酸化AKT。AKT活化后,可以通过调节下游蛋白活性引起一系列的反应,进而调控细胞活性。PI3K/AKT通路活性的改变对BMSCs的存活、增殖、迁移、血管生成、细胞因子的产生和分化也起着十分重要的调节作用。该通路对BMSCs定向迁移来说也至关重要,多种引起干细胞CXCR4过表达起因素都是通过活化该通路而实现其作用的。该通路的抑制剂预处理干细胞可以降低干细胞CXCR4的表达。P13K/AKT通路能被多种理化因素活化,辛伐他汀就是其中的一种。在多种细胞内,比如内皮祖细胞、内皮细胞、足细胞等,辛伐他汀能够激活该通路。然而辛伐他汀能否在BMSCs激活该通路尚未见报道。如果辛伐他汀能够促进BMSCs的CXCR4表达,那么PI3K/AKT通路是否参与这一过程尚待研究。microRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的,不参与蛋白质编码的单链RNA分子,通过对靶基因的mRNA进行转录后调控而在一系列的生物学过程中起重要作用,包括细胞的分化、细胞迁移的调节、细胞增殖分化的调控,等等。BMSCs的很多生物学活动受miRNAs调控,例如分化、分泌活动、增殖、存活和迁移等。BMSCs的归巢也可能受miRNAs影响,口前已知有多种miRNA参与调节不同细胞CXCR4的表达。对这些miRNA进行敲除或者过表达均能够影响细胞对CXCR4的表达。如果辛伐他汀能够促进BMSCs的CXCR4表达,那么是否有一种或者多种miRNA参与这一过程值得进一步的研究。本研究旨在是通过辛伐他汀预处理BMSCs,通过观察BMSCs,总CXCR4及细胞表面CXCR4的表达情况、向SDF-1α定向迁移能力的变化以及在动物模型中细胞的归巢能力的改变来明确辛伐他汀能否促进间充质干细胞定向迁移;通过观察在辛伐他汀促进CXCR4的表达过程中PI3K/AKT通路的活性变化以及抑制该通路能否抑制辛伐他汀对CXCR4的过表达作用,来确定PI3K/AKT通路是否参与其中;通过观察这一过程中miRNA表达变化以及表达变化明显的miRNAs中是否有以CXCR4为靶基因的,来确定miRNA是否参与调控这一过程的。最后验证所研究的miRNA的表达是否与PI3K/AKT的活性程度有关。总的来说,本实验探讨辛伐他汀对BMSCs归巢能力的影响及其机制,并探讨辛伐他汀能否影响BMSCs对静脉桥再狭窄的防治功能。本研究分为三个部分。第一部分辛伐他汀促进BMSCs归巢并提高其防治桥血管狭窄的功能目的:研究辛伐他汀对BMSCs的CXCR4表表达及体外、体内定向迁移能力的影响,探讨辛伐他汀对干细胞移植防治桥血管狭窄功能的改善。方法:1.用不同浓度的辛伐他汀(0、0.1、 0.33、 1 u M)刺激BMSCs,48h后通过Westen blot检测总蛋白中CXCR4达量的变化;辛伐他汀刺激BMSCs48h后,通过流式细胞术检测细胞表面CXCR4表达变化情况。2.用Transwell小室检测BMSCs在辛伐他汀(终浓度1μM)和/或AMD 3100(一种抑制CXCR4趋化因子受体拮抗剂,终浓度5 u g/mL)作用下向SDF-1α迁移。分为三组:对照组、辛伐他汀组、AMD 3100+辛伐他汀组。通过与对照组比较研究辛伐他汀在体外对BMSCs归巢能力的影响并确定该影响是通过调节CXCR4表达来实现的。3.建立大鼠静脉移植桥血管模型并给予辛伐他汀及AMD3100。分组如下:a)对照组,n=12,无特殊处理;b)静脉移植组,n=12,实验动物只行静脉桥血管移植手术;c)细胞移植组,n=24,实验动物接受静脉桥血管移植手术及间充质干细胞移植;d)辛伐他汀组,n=24,实验动物除接受静脉桥血管移植手术及间充质干细胞移植外,每日还接受小剂量辛伐他汀(0.5 mg/kg)灌胃;e)AMD 3100+辛伐他汀组,n=24,实验动物除接受静脉桥血管移植手术及间充质干细胞移植外,每日还接受小剂量辛伐他汀(0.5 mg/kg)灌胃以及腹腔注射AMD3100 (5 mg/kg/day)模型建立成功后,再经尾静脉输注移植CM-DiI标记的BMSCs(1×108个/ml,0.2mL每只实验动物),7天后观察各组桥血管部位标记细胞数目,以检测移植BMSCs在体内归巢潜能,28天后组织学检测各组动物静脉桥血管新生内膜形成情况,评价干细胞移植以及联合应用辛伐他汀对新生内膜增生的抑制效果。结果:Western blot表明,随着辛伐他汀浓度的增加,BMSCs内总CXCR4的表达逐渐增加,没有辛伐他汀干预的情况下最低,辛伐他汀浓度最大时(1μM),表达量最高。流式细胞检测发现,辛伐他汀能够提高BMSCs表面CXCR4的阳性表达率,辛伐他汀组样品细胞表面平均荧光强度强于对照组样品细胞,中位荧光强度较对照组也有所增强。在SDF-1α趋化作用下,与正常培养BMSCs比,辛伐他汀刺激48h后的BMSCs迁移明显增加。AMD 3100阻断CXCR4之后,辛伐他汀干预所引起的BMSCs定向迁移增加受到抑制。细胞移植至动物模型内7天后,在桥血管内膜处可见大量CM-DiI标记的移植细胞。与单纯细胞移植相比,应用辛伐他汀能明显促进BMSCs向移植静脉桥血管内膜处迁移,AMD 3100可以抑制这一作用,降低了辛伐他汀对干细胞归巢的促进作用。28天后,桥血管新生内膜HE染色发现,较单独应用干细胞移植相比联合应用辛伐他汀及干细胞移植能够更有效的减少新生内膜的产生。应用AMD 3100后,辛伐他汀对干细胞防治桥血管狭窄作用的改善被削弱。结论:在辛伐他汀作用下,BMSCs的CXCR4表达增加,尤其是细胞表面CXCR4表达增加,向SDF-1α趋化迁移能力增强,应用AMD3100可以抑制这一增强的趋势,进一步说明辛伐他汀促进BMSCs定向迁移能力是通过促进CXCR4表达实现的。在动物模型中,辛伐他汀可以促进BMSCs在桥血管内膜的归巢,进而更好的抑制了新生内膜的增生,最终证明辛伐他汀能改善BMSCs移植对桥血管狭窄的防治功能。第二部分PI3K/AKT信号通路参与辛伐他汀引起的CXCR4过表达目的:研究辛伐他汀促进BMSCs过表达CXCR4勺过程中是否有PI3K/AKT通路的参与。方法:1.用不同浓度(0、0.1、0.33、 1 μM)的辛伐他汀刺激BMSCs,48h后通过Westen blot检测AKT及磷酸化AKT表达量的变化并与CXCR4表达量变化程度进行比较。2.PI3K/AKT通路抑制剂LY294002预处理间充质干细胞后,再行辛伐他汀干预,Western blot观察CXCR4, AKT及磷酸化AKT三种蛋白的表达变化情况,分组:对照组,使用正常完全培养基,不添加LY294002及辛伐他汀;辛伐他汀组,培养基是添加辛伐他汀(终浓度1 μM),培养48小时;PI3K抑制剂+辛伐他汀组,培养基中先加入LY294002(终浓度30 μ M)培养2小时以阻断AKT活化过程,然后加入辛伐他汀(终浓度1 μM),培养48小时;PI3K抑制剂组,培养基中加入LY294002(终浓度30 μM),培养48小时。3.为了进一步验证PI3K/AKT通路在辛伐他汀促进BMSCs定向迁移中的作用,我们进行了Transwel1实验。实验也分为四组,各组之间处理与前述相同:对照组、辛伐他汀组、PI3K抑制剂+辛伐他汀组、PI3K抑制剂组。结果:Western blot结果表明,随着辛伐他汀浓度不断增加,p-AKT表达量逐渐增加,对照组培养基中未加入辛伐他汀,细胞内p-AKT表达量最低,该信号通路活性最低,而当辛伐他汀浓度为1μM时,p-AKT表达量达到最大,该通路得到最大程度的激活。p-AKT表达上升趋势与CXCR4表达上升趋势相似,在对照组中,BMSCs未受到辛伐他汀的干预作用,两者的表达量均为最低,随辛伐他汀浓度增加,两者表达量逐渐增加,在辛伐他汀浓度为1 μM时,两者表达量最高,而AKT的表达无显著变化。AKT的活化受到LY294002抑制之后,p-AKT表达下降,CXCR4表达也随之下降。辛伐他汀对p-AKT的表达的促进作用也被抑制剂的预处理削弱,辛伐他汀对BMSCs内CXCR4过表达的促进作用也被抑制,两者表达变化方向一致。应用抑制剂之前,辛伐他汀可以明显的促进干细胞的定向迁移;应用抑制剂之后,该促进作用明显降低。与对照组相比,单独应用抑制剂并没有明显的减轻细胞的定向迁移,可能跟BMSCs经过培养后,CXCR4阳性细胞明显减少有关。结论:在辛伐他汀作用下,BMSCs内PI3K/AKT信号通路激活,磷酸化AKT促进CXCR4的表达。抑制该通路可以抑制CXCR4表达的同时也能减弱辛伐他汀对CXCR4表达的促进作用,进而抑制了BMSCs的定向迁移能力。PI3K/AKT通路参与辛伐他汀促进CXCR4表达的过程.第三部分miR-9参与辛伐他汀引起的CXCR4过表达,其表达也受PI3K/AKT/通路调控目的:研究辛伐他汀干扰BMSCs后,与CXCR4相关程度高的miRNAs表达的变化,并验证其是否以CXCR4为靶基因。同时研究其表达与PI3K/AKT通路活性的关系。方法:1.根据TargetScan 5.2, PicTar,及miRanda的预测,找出可能以CXCR4为靶基因的miRNA(预测结果显示具有较好评分),并以这些miRNA为目标进行研究。通过RT-qPCR检测辛伐他汀作用下这些miRNA表达的变化,根据变化水平,筛选出可能相关的miRNA。2.根据筛查的miRNA表达情况我们发现miR-9表达下降最明显,因此,实验中选miR-9作为研究口标。1)瞬时转染miR-9的模拟物及抑制物后观察间充质干细胞CXCR4表达的变化:a) Western blot检测总蛋白中CXCR4含量,分组为模拟物组(瞬时转染模拟物Mimics片段)、阴性对照组(瞬时转染阴性对照Negative Control片段)、抑制物组(瞬时转染抑制物Inhibitor片段)、抑制物阴性对照组(瞬时转染抑制物阴性对照Inhibitor N. C.片段);b)流式细胞术检测BMSCs表面CXCR4表达,包括阳性率、平均荧光强度、中位荧光强度,分组为对照组、模拟物组、抑制物组,各分组处理同上。2) Transwell实验检测瞬时转染miR-9的抑制物对BMSCs向SDF-1α定向迁移能力的影响。分组为对照组(不转染)和抑制物组(瞬时转染抑制物Inhibitor片段)。3)将含有miR-9靶序列(野生型)及突变序列(突变型)的报告基因质粒与miR-9模拟物/阴性对照片段共转染进BMSCs。检测细胞内荧光素酶表达情况以验证CXCR4是否为miR-9的靶基因。分组:a)野生型质粒转染组,仅转染野生型质粒,b)野生型质粒+模拟物转染组,共转染野生型质粒以及模拟物,c)野生型质粒+阴性对照转染组,共转染野生型质粒以及阴性对照片段,d)突变型质粒转染组,仅转染突变型质粒,e)突变型质粒+模拟物转染组,共转染突变型质粒以及模拟物,f)突变型质粒+阴性对照转染组,共转染突变型质粒以及阴性对照片段。3.研究miR-9的表达与PI3K/AKT通路之间的关系。检测不同浓度辛伐他汀(0、0.1、0.33、1μM)以及LY294002(30 μM)作用下miR-9表达的变化,并将其与磷酸化AKT表达变化趋势进行比较,推测miR-9表达与PI3K/AKT通路的关系。结果:根据TargetScan 5.2, PicTar,及miRanda的预测,我们对辛伐他汀刺激后,BMSCs内40种miRNA表达量进行了分析,其中miR-21、miR-369-3p、miR-132和miR-9表达下降,以miR-9下降最为明显。瞬转后,miR-9的模拟物使BMSCs对CXCR4的表达下降,而其抑制物可以促进CXCR4的表达。流式细胞仪检测表明,miR-9模拟物能够抑制BMSCs表而CXCR4表达,其阳性率降低,平均荧光强度、中位荧光强度也降低,miR-9抑制物可以促进BMSCs表面CXCR4的表达,包括阳性率、平均荧光强度、中位荧光强度较对照组均有所增强。Transwell实验表明,BMSCs向SDF-1α的迁移也被该抑制物增强。双荧光素酶报告基因系统进一步验证了CXCR4为miR-9的靶基因,miR-9可明显抑制转染野生型报告质粒的细胞萤火虫荧光素酶表达,却不能明显抑制转染突变型报告质粒的细胞萤火虫荧光素酶表达。随着辛伐他汀浓度的增加,miR-9表达水平逐渐下降,对照组培养基中未加入无辛伐他汀,细胞内miR-9表达量最高,而当辛伐他汀浓度为1 μM时,miR-9表达量达到最低,与磷酸化AKT的表达趋势相反;而通过LY294002抑制PI3K/AKT通路后,较对照组相比,miR-9表达显著增加。结论:CXCR4是miR-9的靶基因,miR-9的模拟物可以直接抑制BMSCs对CXCR4的表达,抑制miR-9的表达可以促进该细胞总CXCR4及细胞表面CXCR4的表达,促进BMSCs定向迁移能力。辛伐他汀能抑制miR-9的表达,进而促进CXCR4的表达。miR-9的表达可能与PI3K/AKT通路相关,该通路活化程度越高,miR-9表达越低,反之亦然。创新及意义本课题证明辛伐他汀可以提高BMSCs的CXCR4表达水平,明显改善这一细胞在体外及体内的定向迁移能力,联合应用辛伐他汀能促进移植BMSCs向桥血管迁移,提高其预防桥血管狭窄的功能。这对提高干细胞移植治疗的效果有着重要的意义。本课题还对辛伐他汀这一作用的机制进行了研究讨论。首次证明辛伐他汀能在BMSCs中激活PI3K/AKT通路,并通过该通路促进CXCR4的表达。另外本课题也首次证明在大鼠骨髓间充质干细胞中,辛伐他汀可以调节miR-9表达,miR-9可以直接调节CXCR4的表达。本课题还发现miR-9表达水平与PI3K/AKT通路活化相关,具体机制值得进一步研究。


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