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环孢素诱导肝损伤患者血清脂质组学研究

史蕾  
【摘要】:目的:1.建立适用于人血清脂质组学研究的气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)方法。2.使用GC-MS法和LC-MS/MS法分别对环孢素诱导药物性肝损伤组(CILI组)和正常对照组(non-CILI组)的血清样本进行检测。3.采用NIST11和HMDB数据库对上述质谱图进行检索比对,鉴定血清中的脂质,以脂质/内标峰面积比作为相对定量指标。4.使用多维数据统计分析方法,进行组间判别模型的建立,寻找两组间差异性代谢脂质。通过使用Metabo Anlayst和KEGG进行在线分析,探索CILI的潜在生物标记物和相关代谢通路,以期对疾病的发病机制有进一步了解并实现其早期诊断和及时治疗。方法:1.样本使用正己烷提取,氮气吹干后复溶,选择VF-WAXms毛细管色谱柱(0.25mm×30m×0.25μm)在Agilent 7890A-5975C气相色谱质谱联用仪进行测定。载气(高纯氦气)压力为20 psi;程序升温:70℃,保持1min;以20℃/min升温至180℃;然后以6℃/min升温至230℃,保持20min。进样量:1μL,分流比:50:1。质谱进样口温度:250℃;接口温度:270℃;离子源温度:230℃;电离电压:70 eV;四极杆温度:150℃;载气:高纯氦气,1.0 mL/min;选择全扫描模式,30-450m/z。2.样本使用二氯甲烷-甲醇-水三相(v/v/v=1:2:1)提取,氮气吹干后复溶,选择JADE-PAK二醇基色谱柱(250 mm×4.6 mm×5μm)在Agilent 1200-6410液相色谱串联质谱仪进行测定。流动相A:20%异丙醇-20mM甲酸铵,流动相B:20%异丙醇-80%乙腈。流速为0.3mL/min,梯度洗脱:0-2 min,92%B; 2-6 min, 86%B; 6-12 min,80%B; 12-18 min,75%B; 18-24min,65%B; 24-30min, 92%B; 31-45 min,92%B。在线脱气;柱温30℃;进样量20μL。离子源为ESI,选用正离子模式检测;干燥气(N2)流速为10.0 L/min,干燥气压力为40 psi,干燥气温度为325℃,毛细管电压为4000V。选择全扫描模式(SCAN), m/z范围:200-1300。3. GC-MS图谱使用MSD化学工作站软件自带的NIST11数据库进行自动检索匹配,定义相似度大于80%且保留时间漂移小于0.5min的组分为可靠结果。HPLC-MS/MS图谱的解析采用HMDB数据库进行精确分子量检索,定义质量数差异小于0.5 Da且保留时间漂移小于0.5min的组分为可靠结果。4.使用内标峰面积校正GC-MS和HPLC-MS/MS峰面积数据,进行多维数据统计分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。通过PCA法对数据整体进行降维处理,实现组间分离。通过独立监督判别模型PLS-DA,进行组件判别,寻找差异性代谢脂质。最后建立双独立监督的OPLS-DA模型,排除其他干扰因素,选择VIP值1且曼-惠特尼U检验中P值0.05的组分,定义为两组间的差异性代谢脂质。使用LIPDMAPS数据库对差异性脂质进行进一步结构鉴定。导入Metabo Analyst网站进行代谢通路分析,定义得分大于0.01的为CILI相关代谢通路。结合差异性代谢物和相关通路对CILI的作用机制和潜在生物标记物进行分析探讨。结果:本课题共入组103个受试者,根据CIOMS标准分为CILI组(n=43)和non-CILI组(n=60)。通过建立人血清的GC-MS和HPLC-MS/MS检测方法,对血清中的脂质进行了分析,该方法分离度和重现性良好,适用于脂质组学的研究。通过检索比对并限定保留时间漂移后,能够对75种脂质代谢物进行检测。其中14种由GC-MS图谱分析获得,61种由HPLC-MS/MS图谱分析获得。样本数据使用PCA、PLS-DA和OPLS-DA模型进行多元数据统计分析。选择VIP值1且P值0.05的脂质组分,最终确定23种脂质,包括5种脂肪酸(FA)、8种磷脂酰胆碱(PC)、3种磷脂酰乙醇胺(PE)和6种鞘磷脂(SM)和1种胆固醇酯,为CILI组与non-CILI组的差异性脂质。导入Metabo Analyst网站进行通路分析,获得4条相关代谢通路:甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、脂肪酸代谢和鞘脂代谢,相关性得分分别为0.23,0.22,0.05和0.03。结论:本课题通过建立人血清脂质组学的GC-MS和HPLC-MS/MS方法,应用多维数据统计分析方法和代谢通路分析,对CILI组与non-CILI组的血清脂质代谢物进行了研究。获得与CILI发生密切相关的23种差异性脂质代谢物和4条相关脂质代谢通路。研究发现,CILI组的血清中的PC/PE水平有所降低,FA、SM和AA水平有所升高。这些脂质变化可能与脂质蓄积以及肝细胞膜的完整性损伤有关。这些研究结果有助于进一步了解CILI的作用机制并探索其生物标记物。


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