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黄色粘球菌CRISPR系统的功能分析及CRISPR/Cas9在粘球菌中的应用研究

彭冉  
【摘要】:面对恶劣的生存环境,原核生物通常能够开发不同的策略来促进生存,适应不断变化的世界。构成自然防御机制的系统之一是具有区分自身与非自身核酸的能力。核酸可以通过感染、转导、接合或转化插入原核细胞,并且可能具有有害作用。防御机制包括限制性修饰系统、流产感染和表面排除系统,这些系统都是固有的且不具有特异性。而最近报道了一种特异性的防御系统,成簇的规律间隔的短回文重复序列及相关蛋白 CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins),该系统可提供大多数古细菌和细菌针对外来核酸的适应性和遗传免疫。这种免疫机制基于掺入宿主基因组的外来DNA短片段,在转录后引导蛋白复合物靶向外来核酸并促进其降解。迄今为止,已经推测了 CRISPR系统的不同功能,可在包括染色体重排、DNA修复、基因表达调控、孢子和生物膜形成、致病菌抗性的获得以及水平基因转移等方面发挥作用。其中基于Ⅱ型CRISPR/Cas系统构建的新型基因编辑技术,它由识别靶位点DNA序列的sgRNA和Cas9蛋白组成,可对双链DNA进行定点切割。随着研究的深入,CRISPR/Cas9系统及其衍生技术在不同物种的基因组编辑中得到了广泛的应用。粘细菌是一类属于Delta变形菌纲的革兰氏阴性细菌,具有复杂的多细胞社会学行为并能产生丰富的次级代谢产物。粘细菌基因组庞大,且存在大量的重复基因和水平基因转移现象,暗示粘细菌的基因组易于整合外源DNA并进行染色体重排,这些现象都与CRISPR系统的功能相关。通过CRISPR database数据库对已测序的粘细菌基因组分析,发现两株纤维堆囊菌(S.cellulosum So ce 56和S.cellulos So0157-2)和五种粘球菌含有 CRISPR 系统。其中,M.fulvus 124B02基因组包含一个Cas操纵子,该区域内分布61个串联的spacers;M.fulvus HW-1基因组包含2个完整的Cas操纵子,含有130个spacers;M.stipitatus DSM 14675基因组包含2个完整的Cas操纵子,具有79个spacers;作为粘细菌的模式菌株黄色粘球菌M.xanthus DK1622基因组包含3个完整的Cas操纵子,159个spacers。本论文旨在探究黄色粘球菌CRISPR系统的功能,并在粘球菌中利用CRISPR/Cas9新型基因编辑技术建立高效快速的敲除系统,针对低表达的次级代谢基因簇利用CRISPRa技术进行转录激活,为在粘细菌中基因功能研究和次级代谢产物的挖掘提供新型有效的基因编辑工具;同时对黄色粘球菌复制相关的双拷贝DNA聚合酶Ⅲα亚基的功能进行分析,探讨了其在粘球菌环境适应与进化中所起的作用。为了探究黄色粘球菌CRISPR系统在细胞生存、多细胞形态发生、进化中的作用。本论文首先通过在线软件CRISPR database分析了M.xanthus DK1622自身的CRISPR系统,阐述其CRISPR结构特征,对多个CRISPR系统进行归类,描述分布规律,并利用CRISPR Target及BLAST对各个CRISPR基因座区域的spacer序列进行了生物信息学分析,对spacer序列匹配基因编码产物进行分析,发现有的与细菌生存有关,有的与侵染的噬菌体有关,有的与环境适应性有关。进一步,通过对DK1622各个CRISPR/Cas系统依次敲除,分析突变株与野生株在生长状态以及社会学行为之间的差别,从而探究CRISPR/Cas系统在菌株中发挥的功能。发现敲除CR1SPR2削弱了菌株的发育和生孢能力,而且敲除CRISPR3减少了黄色粘球菌DK1622胞外多糖(EPS)的产生,并提高了其自然转化的效率。探究了黄色粘球菌DK1622自身的CRISPR系统如何影响其生理学特征,并为在粘球菌中开发新的基因组编辑工具CRISPR/Cas9清除了自身免疫背景。作为目前粘细菌中遗传背景研究最清楚的菌株,黄色粘球菌DK1622已经作为异源表达宿主并进行了诸多研究。但DK1622基因组庞大,9.14Mb大小的基因组至少有1.4Mb来自于水平基因转移(HGT),大部分用来编码次级代谢产物。而目前M.xanthusDK1622的遗传操作主要通过转导和电穿孔的模式进行,例如:基于attB位点整合的pSWU30 质粒和随机整合质粒pMiniHimar-lacZ质粒可以完成基因插入基因组的目的;基于在橙色粘球菌124B02中发现的可自主复制的质粒构建的可在大肠杆菌与粘球菌间穿梭的pZJY41质粒,可以实现非基因组整合的基因引入。粘球菌中的基因敲除主要通过由PBJ113质粒的抗性基因盒和负筛选基因galK介导的二次同源重组实现,此方法需要两步筛选,第一步抗性筛选发生一次同源重组的菌株,获得的突变株需要第二次基于D-gal致死原理的负筛,获得发生二次同源重组的敲除菌株,该方法通量较低,这导致多基因组合敲除周期较长,而某些基因和反义RNA不能被敲除,同时某些基因敲除造成的染色体结构改变可能带来表型的假象,这些都限制了黄色粘球菌中的相关研究。近年来,大量研究发现来源于细菌免疫系统的CRISPR/Cas系统在基因编辑体现出的巨大的应用潜力。特别是来源于酿脓链球菌的II型CRISPR系统,因为其只需一个Cas蛋白(Cas9)与crRNA和tracrRNA嵌合体形成蛋白核酸复合体,扫描基因组寻找能与spacer互补配对的PAM序列,并进行目的基因的切割形成DNA双链断裂(DSBs)。该方法广泛应用于真核生物,以及少数几种原核生物中,完成了单基因的精准突变以及多基因的同时敲除。为了提高粘球菌属的遗传操作效率,我们建立基于CRISPR/Cas9系统的遗传操作工具用来删除基因组中的基因。我们将密码子优化后的Cas9蛋白基因导入DK1622与ACRISPR染色体,并融合表达荧光蛋白验证了 Cas9能够表达且正确折叠。发展出两种方法来修复靶向DNA双链断裂,一是引入真核生物中常见的不依赖同源模板的非同源末端修复系统(Non-homologousendjoining,NHEJ),通过来自于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1和橙色粘球菌(M.fulvus)124B02的Ku和LigD蛋白行使NHEJ的作用,在Cas9切割目的基因后将两端接头修复,进而引起目的基因不同大小序列的删除;二是将增加了同源重组DNA模板HR,通过同源重组修复CRISPR/Cas9系统形成的双链断裂,完成基因的精确删除。该技术实现了在黄色粘球菌DK1622中大基因的一步敲除,大大缩短了基因组编辑的时间,成为在该菌中进行高效遗传操作的新工具。CRISPR/Cas9系统另一个引人注目的应用是将核酸酶失活的Cas9(dCas9)融合转录激活因子,可以结合目标基因而不进行切割,从而激活靶向基因的表达,称为CRISPRa。其相对传统过表达基因的优势在于针对一些难克隆或者较大的基因,可在基因的转录起始位点(TSS)激活。此方法是利用dCas9融合蛋白来招募RNA聚合酶。利用dCas9-激活因子的案例主要集中在哺乳动物细胞中,通常采用VP64或者p65AD融合到dCas9上,与sgRNA 一起对报告基因或者内源基因进行激活。目前将CRISPRa应用到细菌中的研究还比较少,主要是针对大肠杆菌、天蓝色链霉菌和肺炎链球菌中基因的激活。目前,利用CR1SPR对于微生物次级代谢基因簇进行激活没有被报道。作为粘细菌次级代谢产物异源表达的优秀宿主,黄色粘球菌DK1622具备代时短(4h)、菌体生长分散、可提供所需底物和酶等特点。本实验室之前将纤维堆囊菌So0157-2中合成抗癌聚酮化合物埃博霉素的56kb基因簇,通过转座的方式插入黄色粘球菌中,产量高于其他异源表达菌株,但仍具有提升的空间。我们期望通过CRISPRa对异源表达的埃博霉素基因簇进行转录激活。首先在异源表达埃博霉素的黄色粘球菌株ZE9中构建含有dCas9-激活因子的系统。然后在该基因簇启动子区针对两个转录起始位点(TSS1和TSS2),设计sgRNA引导dCas9-激活因子结合DNA的spacer序列。激活蛋白分别采用了黄色粘球菌DK1622的RNA聚合酶中的Omega亚基和alpha亚基,以及黄色粘球菌全局调控因子Sigma54和ECF Sigma因子CarQ。而且,我们通过目标产物埃博霉素的产量以及各个模块的转录量,比较了不同引导位点的sgRNA对埃博霉素基因簇的激活效果,以及比较了不同激活因子的激活能力。进一步,我们通过把dCas9-激活因子的组成型启动子改为能在黄色粘细菌中使用的铜离子诱导的启动子Pcuo,通过添加不同浓度的铜离子,使埃博霉素的产量有了进一步的提高。首次在粘细菌中建立基于CRISPR/Cas9的激活体系,同时也是在细菌中首次通过CRISPRa对次级代谢基因簇进行激活并获得可观的产物增加,为粘细菌以及其他微生物次级代谢基因簇的发掘提供了有力的工具。在对黄色粘球菌的复制和修复系统的研究中,我们发现所有的已测序粘细菌都具有两个dnaE基因,编码的DnaE是负责细菌基因组复制的DNA聚合酶III复合体的一种α亚基。通过对粘细菌两个dnaE基因进行系统发育分析,发现重复的dnaE基因高度保守且分别进化,说明了它们在粘细菌中的重要性。以黄色粘球菌DK1622作为模式菌,我们确证了dnaE1(MXAN_5844)对细胞生存是必不可少的,而dnaE2(MXAN_3982)编码复制相关的易错酶且可以被删除。dnaE2的敲除对黄色粘球菌DK1622的生长速率和社会型运动的影响甚微,但显著减弱了其发育和生孢能力,发育和生孢的变化可以被dnaE2的回补恢复。通过RT-qPCR对dnOE1和dnaE2在生长和发育阶段的表达量检测,发现dnaE1的表达水平始终高于dnaE2。dnaE2的过表达虽然高于dnOE1,但仍然无法代替dnOE1的功能,体现了dnaE2和dnaE1在蛋白结构上的差别。通过过表达dnaE2,提高了生长能力,增加了突变率,同时增强了发育和生孢的能力,证明dnaE2对DK1622的发育阶段起着重要的作用。因此推断dnaE2对基因组突变率起着平衡作用,既保证在恶劣环境中保持突变率保证菌株适应性,更避免了突变率过高对细胞带来的损害,表明dnaE2对黄色粘球菌的进化有一定的推动作用。本论文相关工作提出以下推论:1.利用在线软件对黄色粘球菌DK1622中CRISPR系统进行分析、分类,分析spacer序列的来源,系统研究了其中3个CRISPR系统与DK1622发育、生孢、运动等社会学行为以及自然转化之间的关系。将敲除自身CRISPR的菌株与外源CRISPR/Cas9系统的引入联系起来,排除自身免疫干扰。2.首次在粘细菌中开发了基于CRISPR/Cas9系统的基因敲除工具,实现了大基因的一步敲除,为以后在该菌中进行多基因同时删除或突变奠定了基础。3.首次将CRISPRa应用到微生物次级代谢基因簇的激活,成功提高了基因簇各个模块基因的转录水平和目标产物埃博霉素的产量。为基因组中未知功能基因簇的研究以及新的次级代谢产物的发现提供了新的工具。4.以黄色粘球菌DK1622为模板,研究了粘细菌的双拷贝基因dnaE,作为DNA聚合酶Ⅲα亚基的一种,在生活周期中起的作用,以及对其社会学行为产生的影响。提出了dnaE2对粘细菌环境适应和进化所起的潜在作用。


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