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生产白藜芦醇基因工程菌株的构建与表达研究

程皓  
【摘要】:白藜芦醇(Resveratrol,Res)是一种非黄酮类多酚化合物,广泛存在于虎杖、葡萄等植物中。近年来,研究者发现白藜芦醇具有很多对人类有益的功效,比如抗癌、抗氧化、延缓衰老、预防心血管疾病等,这使得白藜芦醇成为最有前途的天然活性物质之一,不仅有成为抗癌新药的潜力,还广泛用于保健品、化妆品市场。然而,白藜芦醇在植物中的含量较低,从植物中提取纯度低,难度大,无法满足市场的需求,因此,开发制取白藜芦醇新方法尤为重要。本论文的研究以基因工程技术为基础,利用微生物繁殖快,代谢强的特点构建能够生产白藜芦醇的工程菌,并通过工程菌的发酵培养,将原料4-香豆酸转化为白藜芦醇,并达到了一定的产量,为将来的工业化打下了基础。微生物合成的方法不仅工艺成熟,而且目标明确,同时也保护了植物资源。在本论文中,首先将合成白藜芦醇的两个关键酶基因4cl和sts分别从拟南芥和葡萄中克隆出来。4cl基因表达蛋白为4-香豆酸:CoA连接酶,催化底物4-香豆酸合成4-香豆酰辅酶A;sts基因表达蛋白为芪合酶,催化1分子的4-香豆酰辅酶A和3分子的丙二酸单酰辅酶A生成白藜芦醇。构建了 3个重组质粒,第一个是共表达体系pETduet-sts-4cl重组质粒,它能够分别表达4cl和sts基因;第二个是融合表达体系pETduet-sts::4cl重组质粒,它能够表达融合蛋白STS::4CL;第三个是融合表达体系pETduet-4cl::sts重组质粒,它能够表达融合蛋白4CL::STS。将这3个重组质粒分别导入大肠杆菌表达菌株BL21中,得到能够生产白藜芦醇的工程菌。在这3个工程菌中加入1 mM的底物4-香豆酸,并经过发酵后,HPLC检测白藜芦醇产量分别为:12.0mg/L,61.1mg/L,24.2 mg/L。考虑到作为底物之一的丙二酰CoA在细胞中的含量不足,本研究首次将拟南芥中克隆出来的丙二酰CoA合成酶基因aae构建到产白藜芦醇工程菌中,形成的重组质粒为pETduet-sts::4cl-aae,并利用大肠杆菌BL21作为宿主菌,在加入底物4-香豆酸和丙二酸的条件下,发酵生产白藜芦醇产量达80.8 mg/L。


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