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Apelin对胃癌生物学功能的影响及其分子机制的研究

郝延璋  
【摘要】:胃癌是我国高发恶性肿瘤之一,尽管手术及术后辅助治疗不断进步,但预后仍较差,其主要原因是肿瘤的复发和转移。肿瘤的复发和转移是多基因、多因素相互作用的结果,其中血管生成是关键因素之一。而肿瘤血管生成是一个多步骤、多因子参与并调控的过程。血管紧张素受体相关受体蛋白(putative receptor protein related to angiotensin Ⅱ type-1 receptor,APJ)是 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)家族成员之一。1998 年 Tatemoto 等从牛胃中分离提取出了 APJ的内源性配体(APJ endogenous ligand,Apelin)。近来Apelin在肿瘤血管生成及肿瘤发展中的作用逐渐受到重视。已有研究发现Apelin通过自分泌及旁分泌等形式参与多种恶性肿瘤的发生和发展。Apelin通过激活丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinases/extrallular signal regulated protein kinase,MAPK/ERK)及磷酷酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B(Phosphatidylinositol 3-kinase/Protein Kinase B,PI3K/AKT)等信号通路,发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭、抑制凋亡、促进血管和淋巴结管生成等作用。体内实验中也发现Apelin具有促进肿瘤增殖及促血管形成作用。前期研究中我们已发现在进展期胃癌患者组织中APJ的表达和同步放化疗+恩度的疗效及预后呈负相关。然而,关于Apelin在胃癌中的表达水平以及其内在调控机制目前尚未见报道。本研究在已有研究的基础上,首先探讨Apelin在胃癌中的表达及其在胃癌发生、发展、预后中的作用;然后,探讨Apelin对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制;最后通过体内实验进一步明确Apelin表达对胃癌增殖的影响及其和血管形成的关系。旨在为Apelin作为胃癌的预后指标、分子靶向治疗潜在靶点奠定研究基础。第一部分Apelin在胃癌组织中的表达及其临床意义目的明确胃癌组织中Apelin、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达水平,分析Apelin、VEGF表达与微血管密度(microvessel density,MVD)的相关性。分析Apelin、VEGF的表达水平与患者临床病理因素及预后的关系。方法1.回顾性分析2009年1月至2011年12月滨医附院接受胃癌根治术(D2且R0)并完成术后辅助治疗的胃癌患者178例。收集178对癌组织及癌旁组织。2.利用免疫组织化学技术Envision法检测Apelin、VEGF蛋白在胃癌组织及对应的癌旁组织中的表达水平。分别根据Apelin、VEGF表达水平分为阳性表达组和阴性表达组。CD34标记用于计算MVD。3.卡方检验分析Apelin、VEGF表达水平与临床病理因素的关系。4.t检验分析Apelin、VEGF表达与MVD的关系。5.Spearman秩相关检验分析Apelin与VEGF表达的相关性。6.应用Kaplan-Meier及COX比例风险模型分析Apelin在胃癌患者预后中的作用。结果1.Apelin呈现胞浆内弥漫性表达,癌组织阳性率高于癌旁组织(49.44%vs 29.78%,P0.01)。VEGF在胃癌组织中也为胞浆表达,癌组织阳性率高于癌旁组织(55.62%vs 39.89%,P0.01)。2.Apelin表达与脉管侵犯、N分期、T分期、病理类型、神经侵犯相关(P0.05),与性别、年龄、发病部位无关(P0.05);VEGF表达与T分期、脉管侵犯、N分期相关(P0.05),与性别、年龄、发病部位、病理类型、神经侵犯无关(P0.05)。3.Apelin 阳性组 MVD 为 33.086±7.862,Apelin 阴性组 MVD 为 21.071 土6.320,两组间差异有统计学意义(P0.05)。VEGF阳性组MVD为29.075土8.193,VEGF阴性组MVD为19.638 土 5.614,两组间差异有统计学意义(P0.05)。4.Apelin与VEGF蛋白在胃癌组织表达呈正相关性(rs=0.856,P0.01)。5.Apelin 阴性组 1、3、5 年总生存率(overall survival rate,OS)分别为 97.78%、76.67%、53.33%,Apelin 阳性组 1、3、5 年 OS 分别为 97.73%、62.50%、28.41%,中位生存期60.2月vs 40.7月,两组间差异有统计学意义(P0.01)。Apelin阴性组 1、3、5 年无进展生存率(progression free survival rate,PFS)分别为 94.44%、65.56%、40.00%,Apelin 阳性组 1、3、5 年 PFS 分别 96.60%、44.32%、19.32%。中位进展时间分别为49.8月vs30.5月,两组间差异同样具有统计学意义(P0.01)。6.COX单因素分析示Apelin、VEGF、T分期、N分期、脉管侵犯、病理类型与预后相关(P0.05);年龄、性别、发病部位、神经侵犯和预后无关(P0.05)。COX多因素分析示Apelin、VEGF、脉管侵犯并非独立不良预后因素,而N分期、T分期、病理类型为独立不良预后因素。结论Apelin在胃癌组织中表达高于癌旁组织,其表达与脉管侵犯、淋巴结转移、T分期、VEGF表达、MVD等情况相关。Apelin可能通过促进血管形成参与了胃癌的生长及转移,从而导致患者预后差。第二部分Apelin表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制目的明确胃癌细胞系中Apelin表达情况。探讨Apelin表达水平对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制。方法1.培养胃癌细胞系 MGC-803、SGC-7901、HGC-27。2.应用实时定量反转录聚合酶链反应(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real time RT-PCR)、免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测细胞中Apelin mRNA、Apelin蛋白、Apelin分泌蛋白的水平。3.构建pcDNA3.1-Apelin,脂质体瞬时转染胃癌细胞系MGC-803。4.应用MTT、Transwell实验、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪分别检测Apelin基因过表达前后、Apelin-13(Apelin的主要亚型)诱导前后细胞的增殖、侵袭及凋亡情况。5.Western blot法检Apelin过表达前后、Apelin-13诱导前后MGC-803细胞系中pERK、pAKT、细胞周期蛋白D1(CyclinDl)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达。结果1.Apelin mRNA在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系中相对表达水平分别为1.000±0.344、14.596±2.928、29.755±5.067。三者之间表达水平差异均有统计学意义(P0.05)。2.Apelin蛋白在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系中相对表达水平分别为 0.150±0.067,0.420±0.102,0.873±0.114。三者之间 Apelin 蛋白表达水平差异有统计学意义(P0.05)。3.在MGC-803、SGC-7901、HGC-27细胞系上清液中Apelin分泌水平分别为 132.00±31.97pg/ml,492.33±64.21pg/ml,761.00±45.52 pg/ml。三者之间差异有统计学意义(P0.05)。4.应用基因克隆技术成功构建Apelin基因真核表达载体pcDNA3.1-Apelin并转染胃癌细胞系MGC-803。5.Apelin-13诱导促进胃癌细胞MGC-803增殖,2.5μmol/L为最佳作用浓度,诱导后细胞增殖能力差异从12h开始,持续至48h。6.Apelin过表达促进MGC-803增殖,细胞增殖能力差异从24h开始,持续至 48h。7.未处理细胞、Apelin-13诱导细胞穿膜细胞数分别为102.00±24.59、406.33±37.62,两者差异有统计学意义(P0.01)。pcDNA3.1转染细胞、pcDNA3.1-Apelin转染细胞穿膜细胞数分别为111.00±33.30、302.33±47.23,两者差异有统计学意义(P0.01)。8.未处理细胞、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)诱导细胞、SAHA+Apelin-13诱导细胞、SAHA诱导的pcDNA3.1转染细胞、SAHA诱导的pcDNA3.1-Apelin转染细胞的凋亡率分别为(7.300±1.745)%、(15.100士3.997)%、(14.000±3.899)%、(17.275±4.158)%、(14.425±4.393)%。SAHA诱导前后细胞凋亡率差异有统计学意义(P0.05)。而SAHA诱导组和SAHA+Apelin-13诱导组间凋亡率差异无统计学意义(P0.05)。和SAHA诱导的pcDNA3.1转染细胞相比,SAHA诱导的pcDNA3.1-Apelin转染细胞凋亡率差异同样无统计学意义(P0.05)。9.Apelin 过表达、Apelin-13 诱导均可导致细胞中 pERK、Cyclin D1、MMP-9表.达上调,而pAKT表达水平无显著变化。结论1.胃腺癌细胞系MGC-803、HGC-27、SGC-7901中Apelin表达水平有差异,MGC-803中ApelinmRNA、蛋白、分泌蛋白在三个细胞系中均为最低。2.Apelin过表达、Apelin-13诱导促进胃癌细胞系MGC-803细胞增殖、侵袭。3.SAHA可以诱导胃腺癌细胞系MGC-803细胞凋亡,但Apelin过表达、Apelin-13诱导在该过程中未引起凋亡抵抗。4.Apelin可能通过激活MAPK/ERK信号通路上调Cyclin D1、MMP-9的表达从而发挥其作用。第三部分Apelin过表达对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及其与血管生成的关系目的明确Apelin过表达对胃癌裸鼠皮下瘤生长的影响并探讨其和血管生成的关系。方法1.通过慢病毒介导及嘌呤霉素筛选建立pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞系及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞系;2.应用pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞建立胃癌皮下移植瘤模型;3.对比观察两组胃癌皮下移植瘤生长情况,绘制体积生长曲线;4.杀鼠取瘤后测量皮下移植瘤重量,计算增殖率;5.CD34标记,免疫组化Envision法检测裸鼠皮下瘤内MVD。结果1.成功建立pLV-puro-Apelin稳定转染MGC-803细胞系及pLV-puro-NC稳定转染MGC-803细胞系。2.14只裸鼠随机分为对照组及Apelin过表达组,分别接种pLV-puro-NC-MGC-803 及 pLV-puro-Apelin-MGC-803 细胞。对照组及 Apelin 过表达组各有6只裸鼠成瘤,成瘤率85.7%。成瘤裸鼠观察至24天,过表达组部分裸鼠出现活动减少,进食差等情况,随终止观察。3.7、10、14、17、20、24天对照组、Apelin过表达组裸鼠皮下移植瘤体积(mm3)分别为 22.656±8.702 vs 26.775±11.745(P0.05)、61.517±23.151 vs 80.836±26.352(P0.05)、106.115±36.515 vs 196.010±66.854(P0.05)、306.789±105.315 vs 567.346±198.854(P0.05)、748.919±214.059 vs 1399.063±499.872(P0.05)、1367.348±444.701 vs 2557.645±684.409(P0.01)。.4.对照组皮下瘤重量为1.70±0.43g,Apelin过表达组皮下瘤重量为2.96±0.61g,两组间差异有统计学意义(P0.01)。皮下瘤增殖率为42.5%。5.Apelin过表达MGC-803细胞裸鼠皮下移植瘤内MVD为168.833±35.078;对照细胞裸鼠皮下移植瘤MVD为112.333±29.859。两组间差异有统计学意义(P0.05)。结论Apelin过表达可以促进胃癌裸鼠皮下移植瘤增殖,这或许和其促进胃癌裸鼠皮下瘤内MVD增加有关。


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