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P18肽通过阻断VEGF/VEGFR-2信号转导抑制肝细胞癌新生血管形成的机制研究

王新  
【摘要】:目的:原发性肝癌已成为了世界范围内严重威胁人们健康的消化道恶性肿瘤,而肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)占据了绝大多数的原发性肝癌病例。HCC因其隐匿的发病、迅速的发展及经常伴随的肝内及肝外远处转移等特性为临床早期诊断和治疗带来了巨大的挑战,有相当数量的患者就诊时已处于不适于进行外科干预的较晚期阶段。作为一种原发于肝脏内的富血管实体肿瘤,HCC在其发生、发展及侵袭、迁移的过程中极度依赖新生血管的形成,目前已广泛应用于HCC临床治疗的靶向药物索拉菲尼亦将抑制肿瘤新生血管形成作为其治疗靶点之一。然而,在相当部分患者中发生的耐药和不良反应限制了索拉菲尼对HCC的临床治疗效果。因此,探寻能够替代索拉菲尼或与其联合应用的新型血管形成抑制剂并进一步研究阐明其作用机制就具有实际的临床需求意义和潜在的临床应用价值。色素上皮衍生因子(Pigmentepithelium-derived factor,PEDF)是一种多功能糖蛋白,属于非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一。在天然存在的抗血管形成因子中,PEDF被认为是最有效的新生血管形成抑制剂之一。PEDF的全活性分子被认为还同时具有神经营养、抗血管渗漏和抗肿瘤等多种生物学活性,但其本身作为一种包含418个氨基酸的大分子分泌蛋白,复杂的空间结构、较低的水溶性和强免疫原性限制了其在体外的合成、纯化和在肿瘤临床治疗中的应用。因此,开发研究具有高效抗血管生成活性的PEDF衍生肽就成了将其生物学活性应用于临床的解决策略之一。先前的研究已经证明PEDF的抗血管生成功能域可能定位于其上的一段34位氨基酸残基(PEDF-34mer),而对PEDF-34mer的进一步水解得到了一段由18位氨基酸构成的短肽,即P18肽。作为一个具有稳定结构的短肽,P18肽能否仍然具有其全长母链蛋白的抗血管形成活性及其发挥该生物学活性的相关机制值得进一步研究。基于此,本课题主要探讨体外合成的P18肽抑制肝细胞癌肿瘤新生血管形成的生物学活性并尝试探索其发挥该活性的作用靶点及其中的相关分子机制,以期为P18肽作为一种可能的肿瘤新生血管形成靶向抑制剂应用于临床提供一定的理论和实验基础。方法:1.体外实验使用阶梯浓度的P18肽分别处理人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein and microvascular endothelial cells,HUVECs)24h、48h 和 72h,通过CellCountingKit-8(CCK-8)方法检测细胞活性并绘制生存曲线,观察P18肽在体外抑制内皮细胞活性的效果并计算其IC50值。提取P18肽处理后的细胞总蛋白,应用蛋白质免疫印迹(Westernblot)方法检测其对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达影响情况。2.选用人肝细胞癌细胞系HepG2建立裸鼠异位成瘤模型,实验组给予不同剂量P18肽(0.1mg/kg、0.5mg/kg)腹腔注射,监测并绘制肿瘤生长曲线,2周后获取肿瘤标本,应用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术和Western blot方法检测异位瘤组织内Ki-67、CD31和血管内皮钙粘蛋白(VE-销粘蛋白)表达水平;同时应用双重免疫焚光标记法(Double immunofluorescence labeling method)检测肿瘤组织内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其活性膜受体磷酸化(p)-VEGFR-2的表达及定位分布情况;应用Western blot检测肿瘤组织中VEGF表达量及VEGFR-2磷酸化水平。以上用以验证P18肽在体内对肝细胞癌肿瘤新生血管形成的抑制能力。3.选用正常条件下培养的HUVECs作为空白对照、给予外源性诱导因子——VEGF-165处理的HUYECs作为阴性对照,划痕实验、Transwell迁移和基质胶侵袭实验用以验证P18肽在体外对HUVECs迁移和侵袭能力的抑制情况,通过Western blot实验检测各组HUVECs中细胞侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)家族中 MMP-2 和 MMP-9 的表达变化情况。4.分别应用VEGF-165、VEGF-165+P18肽处理HUVECs,通过基质胶小管形成实验验证P18肽抑制HUVECs体外成管能力的情况。Western blot实验检测细胞内新生血管形成及结构形态维持所必需的VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin)和E-钙粘蛋白(E-Cadherin)的表达情况。5.应用流式细胞学技术Annexin V-FITC/PI双染法检测P18肽和VEGF-165处理后内皮细胞的凋亡水平,同时提取细胞总蛋白检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达变化情况。6.为进一步明确P18肽对肝细胞癌肿瘤细胞的作用情况,在体外使用P18肽处理HepG2细胞后,应用CCK-8和流式细胞学技术检测细胞凋亡情况,应用基质胶侵袭实验评价肿瘤细胞侵袭能力的变化情况,同时应用Western blot从蛋白层面检测肿瘤细胞凋亡及侵袭相关蛋白的表达变化情况。7.为探索P18肽抑制新生血管形成机制,使用VEGFR-2的特异性抑制剂SU1498作为阳性对照、外源性VEGF-165作为阴性对照,应用Western blot实验检测P18肽对HUVECs细胞膜上VEGFR-2磷酸化激活的抑制情况。应用PI3K/Akt通路特异性激动剂类胰岛素生长因子-1(Insulin-likegrowth factors-1,IGF-1)作为阴性对照,分别检测P18肽处理后细胞内VEGF/VEGFR-2下游的PI3K/Akt信号通路激活情况和线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3的表达水平变化,进一步阐明P18诱导血管内皮细胞凋亡的相关分子机制。结果:1.CCK-8细胞增殖实验结果显示P18肽在体外能够抑制HUVECs细胞活性且该抑制效应具有浓度依赖性,其体外实验的IC50值约为320nmol/L。Western blot实验结果亦显示P18肽在体外诱导HUVECs细胞内促凋亡蛋白Bax表达增加并下调凋亡抵抗蛋白Bcl-2的表达水平,该效应同样具有浓度依赖性。2.体内实验结果显示P18肽可显著抑制HepG2裸鼠异位成瘤的生长。免疫组化和Western blot结果均显示P18肽腹腔注射组异位瘤组织内的新生血管形成标记物CD31和VE-Cadherin表达下调。免疫荧光和Western blot结果显示实验组肿瘤组织内p-VEGFR-2含量较对照组明显下降,提示P18肽可能通过抑制VEGF在细胞膜上的受体VEGFR-2的磷酸化激活来发挥其抗血管生成活性。3.划痕实验和Transwell实验结果显示外源性VEGF有诱导增强HUVECs迁移能力的趋势而P18肽可阻断并逆转该作用效果并在体外抑制血管内皮细胞迁移。基质胶侵袭实验和Western blot实验结果显示VEGF同样能够诱导增强HUVECs对基质胶的侵袭能力而P18肽则可通过下调内皮细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平而抑制其对血管外基质的侵袭能力。4.基质胶小管形成实验结果显示在有外源性VEGF存在的条件下,HUVECs的成管能力较对照组增强,而当同时给予P18肽处理后其体外成管能力则受到显著抑制。Western blot实验检测细胞总蛋白结果显示P18肽处理后的内皮细胞中血管形成相关蛋白VE-钙粘蛋白和E-钙粘蛋白的表达水平均被下调。5.Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡结果显示P18肽在通常培养条件或有外源性VEGF存在的情况下均能够增加HUVECs细胞凋亡率,且这种改变以早期凋亡的增加更为显著。通过检测细胞凋亡相关蛋白表达变化我们得知在有外源性VEGF存在的情况下,体外培养的HUVECs中Bcl-2/Bax蛋白表达量比值较对照组增加,但在培养环境中加入P18肽后,Bcl-2表达减少而Bax表达增加,提示细胞凋亡水平增加,表明P18肽能够逆转VEGF对血管内皮细胞的保护性作用并诱导细胞凋亡。6.基质胶侵袭实验结果显示P18肽在体外同样能够抑制HepG2的侵袭能力,该效应与其下调HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达及上调细胞黏附关键蛋白E-Cadherin的表达水平相关。但CCK-8和流式细胞学实验结果显示P18肽对肿瘤细胞的活性和凋亡水平无明显影响,处理前后细胞内Bcl-2/Bax蛋白表达比值也无明显变化,提示P18肽能够抑制肝细胞癌细胞侵袭能力但不直接影响其增殖。7.在完全培养基中或含VEGF-165的低血清培养基中培养的HUVECs细胞膜上的VEGFR-2蛋白均被检测到具有较高的Tyr1175位点磷酸化水平,而实验组细胞在经P18肽处理后VEGFR-2的磷酸化激活受到明显抑制,在SU1498处理组细胞中也检测到了相同的结果,说明P18肽能够抑制内皮细胞膜上VEGF受体的磷酸化激活,VEGFR-2是其发挥抑制新生血管形成效应的作用靶点。8.对VEGF/VEGFR-2下游信号通路PI3K/Akt的激活情况及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、cleaved Caspase-3/Caspase-3表达水平的检测结果显示P18肽可通过抑制HUVECs细胞内PI3K和Akt分子磷酸化来阻断通路信号转导,进而下调Bcl-2/Bax表达量比值、促进Caspase-3的剪切活化,这种作用在同时加入IGF-1之后被抵消,表明P18肽发挥其诱导内皮细胞凋亡的效应依赖于其对PI3K/Akt通路信号的抑制及由此引起的线粒体凋亡相关蛋白表达活化水平的改变。结论:1.P18肽在体内及体外均可抑制肝细胞癌肿瘤新生血管的形成。2.P18肽通过抑制血管内皮细胞迁移并诱导其凋亡发挥抗血管形成活性。3.P18肽在体外亦可抑制肝细胞癌细胞的侵袭能力但对其细胞活性和增殖无明显影响。4.血管内皮细胞膜上的VEGFR-2受体蛋白为P18肽的作用靶点,P18肽通过阻断VEGF对其的磷酸化激活发挥相应生物学效应。5.P18肽抑制肝细胞癌新生血管形成依赖PI3K/Akt信号通路及其介导的线粒体凋亡途径:通过抑制该通路信号转导P18肽能够下调Bcl-2蛋白表达并促进Caspase-3剪切活化,最终诱导内皮细胞凋亡并抑制新生血管形成。意义:1.验证了 P18肽作为一种独立的功能性短肽分子能够在体内和体外抑制肝细胞癌新生血管的形成;P18肽通过阻断VEGF的生物学效应并诱导血管内皮细胞凋亡来发挥其抗新生血管形成的作用。2.验证了 P18肽的作用靶点为血管内皮细胞膜上的VEGFR-2受体蛋白,P18肽通过阻断VEGF对其Tyr1175位点的磷酸化激活发挥相应生物学效应。3.P18肽抑制肝细胞癌新生血管形成依赖PI3K/Akt信号通路及其介导的线粒体凋亡途径:通过抑制该通路激活和信号转导,P18肽能够下调内皮细胞中Bcl-2的表达并促进Caspase-3剪切活化,最终诱导内皮细胞线粒体凋亡的发生。4.P18肽作为一种有效的新生血管形成抑制剂,研究和探讨其具体作用机制对其将来应用于肝细胞癌的临床治疗以及其他生物来源小分子抗肿瘤血管生成药物的研发具有现实的意义。


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