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急性髓系白血病中转录激活因子ATF5的发现及临床意义

杨亚玲  
【摘要】:研究目的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一类髓系造血细胞恶性克隆增殖引起的高度异质性疾病,病情发展迅速,自然病程仅几个月。除了特殊类型的急性早幼粒细胞白血病外,大部分AML患者化疗缓解后易复发,长期生存率低,预后差,而AML的靶向药物种类也十分有限。因此,发现AML发生发展中新分子、挖掘新的治疗靶标十分重要。生物信息学方法是寻找白血病致病分子的重要筛选工具,本研究运用生物信息学对基因表达数据库GEO中急性髓系白血病数据深度挖掘,筛查AML发生发展与预后评估的候选分子,探究被发现候选分子ATF5在不同阶段AML患者中表达状况、与其它预后指标间的相关性、在AML细胞中发挥的生物学效应及其可能的机制,从而初步评估其作为AML候选靶向干预分子的价值。研究方法1.GEO数据库中急性髓系白血病差异基因分析在GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中选择同时包含急性髓系白血病组和对照组临床样本的基因表达数据,运用R语言在R Studio进行基因芯片质量的检验,合格后再应用R Studio进行差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的分析,选择差异较大的差异表达基因进行分析。在GEO数据库中选择同时有AML标本/细胞系组和对照组的基因芯片数据进行目的基因的表达验证。2.在不同分期AML患者临床标本中检测ATF5的表达水平分别提取正常对照者(IDA患者)、AML初诊患者、完全缓解者及难治复发患者骨髓标本单个核细胞,运用qRT-PCR、Westrn Blot及免疫荧光方法检测ATF5在疾病不同阶段的表达水平。3.AML细胞系诱导体外分化后检测ATF5表达水平分析GEO数据库中AML细胞系诱导分化相关芯片中ATF5表达水平;进一步应用Hemin、DMSO、PMA等体外诱导分化剂诱导AML细胞系U937和HL60向成熟红系、粒系、巨核系血细胞分化后,运用qRT-PCR和Westrn Blot方法分别在mRNA和蛋白水平检测ATF5表达变化。4.特异性siRNA沉默AML细胞系中ATF5表达后检测细胞增殖及凋亡AML细胞系中转染ATF5特异性siRNA沉默ATF5表达后,采用CCK8及Edu实验检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞凋亡率。5.分析ATF5表达水平与患者临床预后之间的关系对TCGA数据库数据进行整理,分析ATF5表达水平与患者年龄、性别、初诊时白细胞数量、FAB分型、细胞遗传学危险度分层及FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH2、RUNX1等基因突变之间的相关性。进而,在不同细胞遗传学危险度分级AML中分析ATF5表达水平,探索ATF5表达水平与细胞遗传学危险度分级间的关系。同时,在GEO数据库中选择基因表达信息与临床生存信息都较完整的AML患者基因芯片数据,将基因表达信息与患者临床信息进行匹配整理后,按照ATF5表达水平分为高表达组和低表达组进行患者总生存的Kaplan-Meier分析。6.ATF5表达相关差异基因的聚类分析为了探索AML中与ATF5表达变化有潜在关系的相关分子,对TCGA中AML数据集中基因表达文件进行整理,分别选取ATF5表达最高的25%和表达最低的25%的患者,运用R Studio进行两组间基因表达的差异分析。接着用GO、KEGG和GSEA进行差异基因富集分析和聚类分析,梳理ATF5表达差异所引起的生物学效应的可能机制。研究结果1.AML基因芯片分析发现ATF5明显差异表达对GEO数据库中同时包含AML患者和正常对照者的基因表达谱数据进行基因表达差异分析,设定筛选条件为log2FC≥2、p值0.01,选出95个差异表达基因,发现转录因子家族分子ATF5在AML患者中表达水平明显高表达。在较大样本量的基因芯片中对AML患者及正常对照者进行表达谱数据分析,发现转录因子家族多种分子在AML患者中均存在表达失调,其中人转录激活因子ATF3、ATF5及ATF6在成人急性髓系白血病中表达均高于对照组;在AML患者及细胞系基因芯片数据分析发现ATF5在AML标本及AML细胞系中均有高表达;进一步分析发现在不同细胞遗传学背景的AML患者中,ATF5表达差异较大,其中APL中表达水平较高。2.ATF5在急性髓系白血病患者标本中高表达,与疾病进程相关应用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光(IF)在AML及正常对照者标本中检测ATF5在骨髓单个核细胞中的表达水平,结果显示:相较于对照组,ATF5在AML患者中表达水平明显较高,当疾病治疗达到完全缓解后,ATF5表达下降,疾病复发后,其表达水平再次升高。3.诱导AML细胞分化后ATF5表达降低在GEO数据库中选择AML细胞系诱导分化相关基因芯片,分析ATF5表达水平,发现诱导分化后ATF5表达明显降低;分别用PMA、Hemin和DMSO诱导AML细胞向巨核系、红系及粒系成熟血细胞分化后,qRT-PCR及Western Blot检测都ATF5表达水平明显降低。表明ATF5介导AML细胞的分化。4.ATF5表达沉然后AML细胞凋亡增加、增殖减低特异性siRNA转染AML细胞系沉默ATF5表达后,CCK-8及EDU实验发现细胞增殖速率减慢,流式细胞术发现细胞凋亡率增加。5.ATF5高表达与AML患者不良预后相关在TCGA数据库中分析AML患者ATF5表达水平与患者年龄、性别、初诊时白细胞数目、FAB分型、基因突变等临床信息间关系,发现ATF5在小于30岁患者中明显低表达,在M5型AML患者中高表达。TCGA数据集中根据细胞遗传学危险度不同分组进行ATF5表达水平分析,发现ATF5在中危组表达高于低危组。对GEO数据库中包含AML患者完整生存信息的基因芯片数据根据ATF5表达水平进行预后分析,发现ATF5高表达与患者不良预后相关。6.通路富集分析ATF5发挥作用的潜在下游基因对TCGA数据芯片中根据ATF5表达水平进行差异分析,设置log2FC≥1,p0.05,共得到268个差异表达的基因,对这268个DEGs进行通路富集分析,富集到GO有18项,其中包括GO-BP的4项,GO-CC的7项,GO-MF的2项和KEGG的5项,同时用GSEA富集到有3项。结果发现氧化磷酸化、蛋白泛素化降解等生物学过程以及RUNX1T1等基因表达变化都可能参与ATF5介导的急性髓系白血病发生发展。研究结论通过对GEO和TCGA数据库中急性髓系白血病基因芯片进行统计分析,发现人转录激活因子ATF5在AML中表达明显升高,ATF5高表达与AML患者临床不良预后有关系;在AML临床标本中检测到ATF5表达升高,与疾病进程相关,细胞系水平研究发现ATF5通过抑制AML细胞分化、凋亡,促进增殖来发挥促癌作用。上述研究提示,ATF5在AML中的异常高表达与疾病发生进展、不良预后相关,有可能成为AML致病和干预的潜在候选靶点。


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