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盐芥TsNAC1转录因子及其在玉米中同源基因功能的研究

刘灿  
【摘要】:盐芥是盐生植物,对高盐高渗环境耐受性强,也是拟南芥的近缘种,其cDNA序列与拟南芥的高度相似,近年来成为了植物非生物胁迫响应研究的模式植物。NAC家族蛋白是植物特有的一类转录因子,在拟南芥中至少有107个成员,参与调控植物的生长发育、细胞凋亡、非生物胁迫响应以及内质网应激等方面。本实验室高峰等发现,盐芥氢离子焦磷酸化酶基因TsVP1在不同物种过表达可提高植株的耐盐性和耐旱性,且在正常栽培条件下也可提高作物产量。TsVP1是拟南芥AVP1的同源基因,但表达受盐胁迫诱导。孙清华等对TsVP1启动子进行缺失突变分析,鉴定出了 130bp的盐响应核心序列,并利用该片段为诱饵,钓取了TsVP1的上游调控因子TsNAC1。为了解TsNAC1的功能,孙清华等构建了TsNAC1过表达和RNAi结构,转化盐芥并获得转基因植株。TsNAC1过表达可以显著提高植物对非生物胁迫,如高盐、干旱、低温和活性氧胁迫的耐受性,但与此同时抑制植株生长,使得过表达植株生物量明显下降。本论文在孙清华工作的础上,开展盐芥转录因子TsNAC1的功能分析及其在玉米的同源基因研究。TsNAC1在盐芥植株生长和抗逆机制中起关键作用利用产生的转基因纯合系确定了TsNAC 过表达明显抑制了植株生长,提高了植株抗逆性,而降低TsNAC1表达水平时植株显著增大,抗逆性变差。针对编码序列和结构信息进行分析得出,TsNAC1和拟南芥的转录因子RD26为同源基因。在酵母和烟草中进行转录激活活性比较,发现TsNAC1相对于RD26具有更高的转录激活活性,这与它们过表达植株的表型变化幅度相对应。利用ChIP-Seq发现TsNAC1通过识别CAT(A)G位点正向调控离子转运相关基因如TsVP1和转录因子MYBHYPOCOTYL ELONGATION-RELATED(MYBH)、HOMEOBOX 12(HB-12)等的表达,负向调控细胞扩张因子LIGHT-DEPENDENT SHORTHYPOCOTYLS1(LSH1)和UDP-XYLOSYLTRANSFERASE2(TXT2),并通过正向调控生长抑制因子MULTICOPY SUPPRESSOROF RA4(MSI4)的表达来减缓细胞扩增的过程,从而使过表达植物表现出生长缓慢的表型。另外,ChIP-Seq数据还涉及到大量的低温响应基因如DIACYLGLYCEROL KINASE 2(DGK2)、ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 5(AAT3)和 CALMODMLIN-BINDING TRANSCRIPTION ACTIVATOR 1(CAMTA1),活性氧胁迫响应基因如ACONITASE 3(AC03)、POLLEN-PISTIL INCOMPATIBILITY2(POP2)、NAD-DEPENDENT MALIC ENZYME2(NAD-ME2)等。这些结果表明TsNAC1对植物非生物胁迫反应和生长起着重要的调节作用,位于调节网络的上游。转录因子TsNAC1与TsHD1协同调控植株的生长和抗逆性利用TsNAC1过表达株系进行Co-IP实验筛选到一个互作转录因子TsHD1。TsHD1可通过其Zinc finger domain形成同源二聚体,对靶基因启动子区域的核心识别位点为TA(T)AATT。采用酵母双杂交、分段蛋白的Pull-down和非变性凝胶电泳等方法确定了 TsHD1可通过其Zinc finger domain和TsNAC1的A subdomain发生互作并与之形成异源二聚体。过表达TsHD1盐芥植株在植株大小上与野生型无明显差异,同时过表达TsNAC1和TsHD1的盐芥植株则明显较小,共表达株系的抗旱能性和耐热性与野生型相比显著提高。利用分别转TsNAC1、TsHD1、TsNAC1TsHD1的盐芥材料进行RNA-Seq、ChIP-qPCR等分析得出,过表达ThHD1上调HSPs和DREB2A的表达来提高植物的耐热性,TsHD1和TsNAC1的共同过表达可通过正向调控热激蛋白(HSP)和干旱胁迫相关基因如转录因子 MYB7796、SALT TOLERANCE ZINC FINGER 1018 等的表达来提高植株耐热性和耐旱性,同时通过抑制细胞壁的发育以及细胞扩大来减缓植株的生长速率。蛋白复合体稳定性分析得出,TsHD1和TsNAC1的异源二聚体与TsHD1或TsNAC1的同源二聚体相比具有更高的稳定性和转录激活活性。TsNAC1和TsHD1在染色质上识别位点与转录组数据对应性分析得出,转基因不同的过表达株系间的转录组差异与不同二聚体比例相关联。进一步分析TsHD1和/或TsNAC1结合基序在靶基因启动子区的分布,发现TsHD1和TsNAC1的异源二聚体结合位点高频次出现在上调表达基因的启动子中,而在下调表达基因的启动子中则位于TATA盒附近。该研究揭示了 TsNAC1和TsHD1在植物生长和非生物胁迫抗性的调节中共同作用于多个靶基因,在功能上表现出协同效应。玉米中TsNAC1的同源基因和其突变体表型建立玉米NAC家族系统树,发现与TsNAC1同源的亚家族中有6个候选基因。其中ZmSNAC1/GRMZM2G347043的表达受盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫的诱导,ZmNAC23/GRMZM2G068973的表达受ABA、干旱和低温胁迫的诱导,ZmNAC20/GRMZM2G180328的表达受ABA和盐胁迫诱导,而其它3个基因的表达则不受非生物胁迫的影响。推测这3个基因在功能上与TsNAC1相似,参与玉米生长和抗逆性调控。它们的表达产物定位于细胞核中,具有强烈的转录激活活性。在正常生长条件下,ZmNAC20、ZmNAC23和ZmSNAC1的表达丰度在V1期的未全展叶和VE期的根尖中最高,在授粉后10天的籽粒中也很高。以玉米Qi319为受体,获得了分别过表达ZmNAC20、ZmNAC23和ZmSNAC1的转基因株系和表达ZmNAC20-GFP、ZmNAC23-GFP和ZmSNAC1-GFP的转基因株系。从玉米W22的Mu转座子插入突变体分离出ZmNAC20、ZmNAC23和ZmSNAC1突变的纯合株系。分析这两类材料与其野生型对照在形态特征和抗逆性方面的差别,确定了 ZmNAC20、ZmNAC23和ZmSNAC1的过表达降低了植株营养生长速率,显著提高了对高盐环境和渗透胁迫的耐受力,而突变体则在苗期对高盐胁迫更敏感,但生物量在正常条件下高于野生型对照。通过酵母双杂交筛选,找到了 3个与ZmNAC20、ZmNAC23、ZmSNAC1可以互作的转录因子,它们是Zmbhlh168、ZmSBP9、Zmfar113。这3个基因的表达模式与ZmSNAC1、ZmNAC23和ZmNAC20十分相似,在授粉后10天的籽粒、V1期叶片、VE期的根部表达水平较高,且受到ABA、高盐胁迫的诱导。参考其它物种的同源基因功能研究,得出此类转录因子分别参与植物的热胁迫响应、光和氧化胁迫响应、负向调控细胞的扩张过程而对植株生长产生抑制效应。ZmNACs调控的下游基因利用 ChIP-Seq 和 EMSA 等方法确定了 ZmSNAC1、ZmNAC23 和 ZmNAC20的结合位点分别为 CA(T/A)G(T/G)G、CA(T/A)G(T/C)G 和(C/T)(A/T)(T/A)G(T/G)G,富集的候选靶基因主要出现在调控生物学过程类别中。进一步的GO分类显示ZmSNAC1、ZmNAC23和ZmNAC20的候选靶基因主要富集在非生物刺激响应、细胞生长、大分子代谢和自我平衡等条目中,其中符合富集倍数10、ABA和盐诱导表达、启动子区含有转录因子识别motif标准的分别受ZmSNAC1、ZmNAC23、ZmNAC20调控的基因有16、14和17个。从中挑选出5、5、6个基因进行酵母单杂交试验,确定了它们是ZmNACs直接调控的下游基因。ZmSNAC1正向调控生长素响应基因AAR3和PHR1、抗逆相关基因OX3和ZmbZIP73/GRMZM2G175870的表达水平,且负向调控生长素响应基因AXR1的表达。拟南芥中这些基因的过表达植株或突变体在生长发育和抗逆性方面与野生型有明显的不同,旁证了 ZmSNAC1参与了玉米生长发育的调控和对非生物胁迫的响应,但作用机制仍不清楚。ZmNAC23通过负向调控木酚素合成关键酶PRR1的表达限制了玉米细胞壁发育,从而减缓植株的生长,并通过负向调控NOX1基因表达引起依赖于PIN1的生长素转运途径受抑,根系伸长速度降低。ZmNAC23负调生长素响应基因SAGT1的表达,后者编码了水杨酸葡糖基转移酶。ZmNAC23正向调控RABGAP的表达,后者编码保卫细胞特异表达的gyp1p蛋白,突变型拟南芥植株在ABA处理后气孔开度远大于野生型的,生物量也有增加。这些资料表明ZmNAC23在玉米生长调控中起有重要作用。在ZmNAC20的过表达株系中,多个生长调控因子的表达水平受到明显的抑制。PGX3是果胶裂解酶超家族成员之一,拟南芥中同源基因在次级细胞壁的发育中起着重要的作用,pgx3-1叶片面积为野生型的60%,气孔开度也明显变小,而植株对干旱和高温环境的适应能力提高。推测ZmNAC20在玉米抗逆机制和生长调控中有其独特的作用。通过比较TsNAC1在盐芥中的调控功能和其在玉米中的同源基因的调控功能,可得出TsNAC1及其同源基因在植物生长速率和抗非生物逆境的调控中起有重要作用,位于调控网络的上游,且调控机制在双、单子叶植物间是相对保守的。


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