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GLB1rs4678680基因变异与乙肝相关的肝细胞癌发病风险之间的关系

王文涛  
【摘要】:目的:尽管肝细胞肝癌(HCC)在常见肿瘤中位列第五,但其仍是全球第三大肿瘤性死因。在中国和其他亚太平洋地区HCC发生率很高,仅中国就占全世界HCC的50%。慢性乙型或丙型肝炎病毒(HBV或HCV)感染、暴露于饮食中的黄曲霉素B以及过量饮酒已被确定为HCC的主要环境风险因素。在中国,约75%肝细胞肝癌病人与HBV感染相关,HBV感染被认为是HCC的主要危险因素。然而,只有15%慢性HBV携带者会患有HCC,这表明宿主遗传因素也可能参与HBV相关HCC的发展。这种观点在东亚人HBV相关肝癌的很多的候选基因和全基因组关联研究(GWAS)中被证实。Clifford等为了确定与肝癌相关的遗传因素,在不同的亚洲人群中进行了全面的全基因组变异分析(包括遗传多态性和拷贝数量变化)。通过检测韩国386例肝癌病例和587例对照病例基因型分型后,他们发现3p21.33 GLB1rs4678680 GT的多态性与肝癌发生风险关系最为密切(优势比为2.27,95%可信区间为1.68-3.08,P值为6×10-7)。GLB1基因编码糖基水解酶35家族,糖基水解酶35家族能够催化神经节苷脂底物和其他糖复合物β-半乳糖末端的水解。越来越多的证据表明GLB1参与了细胞衰老和癌症的发展。SA-b-半乳糖酶活性增加和GLB1 mRNA低表达可导致细胞衰老低表达,这表明GLB1在细胞衰老中起着重要作用。在肿瘤发展长潜伏期期间,致癌基因诱导的衰老已成为包括肝癌在内的肿瘤发生的屏障。陈伟等通过对507例中国肝癌患者和3014名中国对照病例的分析,对照研究 1p36.22,2q32.2-q32.3,3p21.33,8p12,14q32.11 和21q21.3与肝癌之间的关联。然而,在这项研究中他们没有研究GLB1rs4678680 GT单核苷酸多态性(SNP)。因此,GLB1rs4678680单核苷酸多态性是否在中国人肝癌病因学中起作用,目前还不清楚。此外,关于GLB1rs4678680单核苷酸多态性在HBV相关肝癌中的作用知之甚少。方法:我们进行了两个独立病例对照研究,探讨GLB1rs4678680基因多态性和HBV相关肝细胞癌发展风险之间的联系。同时,我们通过研究正常肝组织中GLB1rs4678680基因型以及其mRNA的表达之间的关系来验证rs4678680 SNP在人体内的生物学功能。该研究包含两个病例对照研究组(补充表s1):(a)山东组:1186例HBV相关肝细胞肝癌,性别与年龄均匹配的508例慢性HBV携带者招募于山东大学和山东医学科学院附属山东省肿瘤医院(中国,山东济南)。(b)江苏组:淮安第二医院的620例HBV相关肝细胞肝癌患者,以及性别与年龄匹配的1200例慢性乙肝携带者为对照。病例组及对照组均招募于淮安第二医院,此病例及对照组在之前文献已被报道。此研究中,从56位肝细胞肝癌患者中取得56例肝细胞肝癌组织标本。所有肝细胞肝癌患者均已在淮安第二医院或山东大学附属千佛山医院行根治性切除手术。在手术之前,所有肝细胞肝癌患者均未接受局部或系统抗肿瘤治疗。所有研究对象均为汉族。在招募时,已获得每位患者的知情同意。该研究已被山东省肿瘤医院、山东省千佛山医院及淮安市第二医院评审委员会批准。GLB1 rs4678680多态性采用MassArray系统测定(美国,加利福尼亚,圣地亚哥,Sequenom公司)。GLB1 rs4678680 PCR引物序列5'-ACGTTGGATGAGTCCAAGCCTGCTTTCTTC-3'(正)和5-ACGTTGGATGTCTGCCGAGTTGTTGCAAAG-3'(反)。GLB1 rs4678680 UEP_SEQ 引物 5-CCTCATGCTTTCTTCCCTTTTCT-3'。GLB1 rs4678680 EXT1_SEQ 引物 5-CCTCATGCTTTCTTCCCTTTTCTG-3'。从研究样本中双盲随机抽取15%样本重复测序,重复率为100%。我们检测正常肝组织中GLB1 mRNA表达水平采用的是SYBR-Green(试剂盒)实时PCR法,而对于细胞RNA的分离以及分离后将其逆转录为cDNA,我们采用的是ReverTra Ace qPCR RT Kit(试剂盒)。我们通过采用美国的ABI7500PCR系统对GLB1基因及内参照基因相关表达定量进行三倍复制后再进行计算。5'-GTCTATTCTTCTCCGCTCCT-3'和 5-TGTGCTCCAT CAGTGGTAA-3 是 GLB1 基因的引物,5 '-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'和 5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'是 β-actin 基因的引物。而对GLB1mRNA的表达情况我们则是通过β-actinmRNA的表达来进行推算的。采用Pearson'sχ2检验实验组和对照组中人口统计变量和GLB1rs4678680基因单核苷酸多态性基因型分布的差异。通过逻辑回归模型的优势比和95%可信区间评价GLB1rs4678680基因型与HBV相关肝细胞肝癌风险之间的关联。针对年龄、性别、吸烟及饮酒状况,优势比进行了适当调整。采用Kruskal-Wallis单因子方差分析计算不同rs4678680基因型携带者GLB1 mRNA表达差异。我们采用SPSS16.0对数据进行分析,而且对数据进行双向性测试。P值0.05有统计学意义。结果:表1显示了山东和江苏组GLB1rs4678680 SNP等位基因频率和基因型在病例组和对照组中的分布。rs4678680 G等位基因频率在病例组中为0.087或0.094,在山东或江苏对照组中为0.059或0.058。在病例组和对照组中,所有观察到的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡法则。对比病例组和对照组rs4678680基因型的分布。病例组rs4678680 TT、TG和GG基因型频率,与山东(χ2 = 7.593,P=0.022,DF=2)或江苏(χ2=16.14,P= 3.12×10-4,DF=2)对照组存在显著差异。在山东组和江苏组中,采用非条件逻辑回归分析检验GLB1rs4678680基因多态性和HBV相关肝细胞癌风险之间的关系(表1),结果显示rs4678680 G等位基因为风险等位基因;与TT基因型的个体相比,具有TG基因型的个体发生HBV相关肝细胞癌的比值比为1.51(95%可信区间= 1.10-2.07,P=0.010,山东组)或1.49(95%可信区间= 1.11-1.99,P=0.008,江苏组)(表1)。同时,在两个病例对照组中,与TT携带者相比,rs4678680TG或GG基因型携带者发生HBV相关肝细胞癌的风险显著持续增加(山东组:比值比= 1.53,95%可信区间= 1.12-2.10,P = 0.007;江苏组:比值比= 1.57,95%可信区间=1.18-2.09,P=0.002)。在群组分析中,我们观察到与TT基因型相比,病例组中rs4678680TG基因型出现的概率是1.56(95%可信区间=1.24-1.97,P=1.76 × 10 4)。同样,与TT基因型携带者相比,rs4678680TG或GG基因型携带者发生肝细胞癌的风险是TT携带者的1.52倍(95%可信区间=1.19-1.94,P=0.001)。我们通过对性别分层进一步检验GLB1rs4678680基因型与HBV相关的肝细胞癌发生风险的关联(表2)。在男性中,与TT基因型相比,rs4678680TG或GG基因型肝细胞癌发生风险显著增加(山东组:OR=1.60,95%CI=1.15-2.23;P=0.006;江苏组:OR=1.59,95%CI=1.17-2.16;P=0.003)。然而,在女性中基因多态性与肝细胞癌发生风险无明显关联(P0.05)。在年龄分层分析中,仅在年龄大于57岁的人群中观察到与GLB1 rs4678680 TG或者GG基因型相关的肝细胞癌发生风险升高(山东组:OR=1.63,95%CI=1.01-2.62;P=0.047),而在年龄小于或等于57岁的人群中并未发现(山东组:OR=1.46,95%CI=0.96-2.21;P=0.076)(表3)。在年龄大于57岁的江苏组中观察到相似的结果(rs4678680 TG 或 GG 基因型:OR=2.10,95%CI=1.37-3.21;P=0.001)。在山东和江苏组饮酒人群中,与TT基因型相比,GLB1rs4678680TG或GG基因型与肝细胞癌发生风险的增加有显著关联(山东组:OR=1.90,95%CI=1.26-2.86,P=0.002;江苏组:OR=1.76,95%CI=1.21-2.57,P=0.003)(表4)。然而,在不饮酒的人群中并未发现此结果(P0.05)。由于rs467868位于GLB1 18kb的上游区域,因此,我们进一步使用肝细胞肝癌的组织来检测肝细胞肝癌易感单核苷酸多态性rs4678680是否对于GLB1的表达有等位基因效应。如上图1,我们发现相对于正常肝组织,在肝细胞肝癌组织中 GLB1 mRNA 表达量更加显著(均数±SD)(313.3±33.93vs.189.9±21.1;P=0.003)。在正常组织中,具有rs4678680 TG或GG基因型的GLB1 mRNA表达量明显高于TT基因型(TG或GG:367.5 ±40.2[n=9],TT:155.9 士20.6[n=47];P=0.001)。在肝细胞肝癌组织中也有相似的结果:rs4678680 TG或GG基因型比TT基因型的G1B11 mRNA表达量更显著(TG或GG:590.7±32.2[n=9],TT:260.1±35.0[n=47];P=0.001)(图 1)。结论:在目前研究中,我们采用病例对照设计检测GLB1rs4678680单核苷酸多态性与HBV相关的肝细胞癌发生风险的联系。尽管GLB1rs4678680多态性的肝细胞癌的基因易患性体质首次在韩国人群中通过全基因组关联分析得出的,但仍然是第一次在不同种族人群中有效的大样本量的研究。我们在中国人群中发现,与TT基因型的个体相比,携带GLB1rs4678680TG或GG基因型的个体更容易患肝细胞癌。在56例人肝脏组织样本的基因型-表型相关性研究中,rs4678680 TG或GG与GLB1 mRNA表达增加有统计学意义。GLB1基因提供生成β-半乳糖苷酶的引物。这种酶定位于溶酶体中,溶酶体是存在于细胞中的间隔,他们溶解并且使不同类型的分子再循环。在溶酶体内,GLB1帮助分解一些特定的分子,包括GM1神经节苷脂和硫酸角质素。Caldwell等发现GLB1活性是准确鉴定胰腺中非增殖性恶化前细胞的小而异质群体的唯一生物标志物,这说明了 GLB1用于预测胰腺肿瘤形成前的衰老状态的实用性。同时,在福尔马林固定石蜡包埋的组织中增加的GLB1对于衰老样表型是一种很有价值的标记物,并且与增加的前列腺癌的发生相关。所有的这些证据证明了 GLB1包含的致癌作用,可能是通过调节细胞衰老完成的。意义:我们的研究证明,在中国人群中,GLB1rs4678680多态性与HBV相关肝细胞肝癌发生风险相关,突出了 GLB1与细胞衰老在肝细胞肝癌病原学中的作用。


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