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CUL4B在甲状腺乳头状癌中的表达及促进肿瘤增殖和侵袭的机制研究

谷海燕  
【摘要】:甲状腺癌是最常见的恶性内分泌系统肿瘤,近些年来,它的发病率快速上升。其中,甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)的发病率最高,约占80%。PTC通常被认为具有惰性的生物学行为,总体预后良好,十年生存率、甚至二十年生存率均可达到90%以上;然而,仍有15-35%的病人在长期随访时会出现肿瘤复发,进而导致差的预后。因此,临床迫切需要鉴别出这些具有不良预后的病人,探寻其具有更高侵袭特性的机制,从而为肿瘤的精准治疗提供依据。CUL4B属于Cullin家族,它是泛素E3连接酶(Cullin-Ring E3 ubiquitin ligase complexes,CRLs)的重要骨架蛋白,CRLs是目前己知的最大的一类ubiquitin连接酶,可使体内蛋白经ubiquitin-蛋白酶体途径降解,在细胞信号转导、周期调节、DNA修复等众多细胞活动中发挥重要功能。目前,在肿瘤中CUL4B的功能日益被重视,研究者们认为它会是一个新颖的致癌因子。我们在之前的研究工作中也发现CUL4B在胆管癌、胃癌和前列腺癌中高表达,并可促进肿瘤的侵袭。然而,在肿瘤中,CUL4B的研究刚刚起步,其在甲状腺癌中是否起到一定的功能仍未见有报道,所以,本课题结合生物信息学数据,运用临床组织标本、细胞及动物模型,分析了CUL4B在甲状腺癌中的表达及其表达与临床病理特征和预后的关系,并初步探讨了 CUL4B在PTC中的功能及潜在分子机制,希望为PTC的危险程度分层、不良预后病人的筛选及侵袭性肿瘤的治疗提供新思路。第一部分CUL4B在甲状腺乳头状癌中的表达及临床病理特征和预后分析目前,一些临床病理特征如病人年龄,肿瘤大小,TNM分期,远处转移以及一些分子生物学指标如BRAF V600E及TERT突变等通常被用来对PTC进行预后评估,但不同研究的结果存在很大争议,且对肿瘤复发的评估作用有限。而近期的研究显示,CUL4B在多种肿瘤中高表达,并与肿瘤的复发和预后密切相关。因此,在这一部分中,我们运用临床组织标本,同时结合生物信息学,分析了CUL4B的在甲状腺癌中的表达及其表达与临床病理特征和复发的关系,并探讨了影响PTC复发的相关因素。取得了如下结果:1.CUL4B在甲状腺癌组织中高表达,并与PTC复发相关:我们将36例甲状腺正常组织、159例PTC及19例甲状腺未分化癌组织制作组织芯片,用免疫组织化学法检测了 CUL4B的表达,分析了CUL4B的表达水平与PTC相关临床病理学特征及复发的关联性,并运用TCGA/GEO数据库分析了CUL4B在甲状腺中的表达。结果显示,CUL4B的表达在甲状腺癌中明显高于正常组织,且在甲状腺未分化癌最高;CUL4B的表达水平与PTC的复发显著相关。CUL4B的过表达与PTC的组织学类型、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移及腺外侵犯高度相关。2.PTC的复发与病人年龄,肿瘤大小,TNM分期,淋巴结及远处转移高度相关。55岁的年龄分界值对PTC复发的预测价值更高。高细胞型PTC与非侵袭性(经典型和滤泡型)PTC在年龄、肿瘤的多灶性、大小和TNM分期上有显著统计学差异。多因素分析的结果示,远处转移及TNM分期是影响PTC复发的独立风险预测因子。研究结论:1.CUL4B在甲状腺癌组织中高表达,且与PTC的复发相关。2.远处转移及TNM分期是影响PTC复发的独立风险预测因子。第二部分CUL4B在罕见侵袭性亚型甲状腺乳头状癌中的表达近年来,侵袭性亚型PTC逐渐受到研究者们的关注,病人往往预后较差,早期出现肿瘤的复发及转移。接下来,我们特别关注了CUL4B在侵袭性亚型PTC中的表达情况,同时,我们在其中发现了一例罕见的高表达CUL4B的柱状细胞型PTC(Columnar cell variant of papillary thyroid carcinoma,CCV-PTC)具有分泌β-hCG的特点,这在文献中尚无报道,我们对其临床病理特征进行了总结,并初步分析了β-hCG在甲状腺滤泡细胞源性肿瘤中的表达及意义。取得了如下结果:1.CUL4B在侵袭性亚型PTC中的表达显著高于非侵袭性亚型PTC:我们特别关注了CUL4B在侵袭性亚型PTC中的表达,结果显示,CUL4B在侵袭性亚型PTC中的总体表达率明显高于非侵袭性亚型PTC,两组具有显著统计学差别;CUL4B的表达率在实性和柱状细胞型PTC中最高,其中入组4例柱状细胞型PTC均高表达CUL4B。2.柱状细胞型PTC是非常少见的侵袭性亚型PTC,罕见分泌β-hCG,β-hCG的表达更常见于甲状腺未分化癌:在分泌β-hCG的柱状细胞型PTC中,肿瘤分泌的β-hCG导致了病人甲状腺功能亢进的副肿瘤综合征。柱状细胞型PTC是非常少见的侵袭性亚型PTC,我们对其进行文献复习的结果显示,它以柱状肿瘤细胞假复层排列为特征,预后与生长方式有关。接下来,我们用免疫组织化学的方法检测了β-hCG在一组甲状腺滤泡细胞源性肿瘤组织中的表达,并对滤泡细胞源性甲状腺癌相关的副肿瘤综合征进行了文献复习。结果显示,β-hCG在滤泡细胞源性甲状腺癌中罕见表达,与高分化的PTC相比,β-hCG的表达更常见于甲状腺未分化癌,其预后意义尚无明确结论。滤泡细胞源性甲状腺癌相关的副肿瘤综合征相对少见,包括皮肤、造血、内分泌及神经功能障碍等方面。研究结论:1.CUL4B在侵袭性亚型PTC中的表达显著高于非侵袭性亚型PTC。2.柱状细胞型PTC是非常少见的侵袭性亚型PTC,罕见分泌ββ-hCG。在滤泡细胞源性甲状腺癌中,β-hCG的表达更常见于甲状腺未分化癌,其预后意义尚不明确。第三部分CUL4B促进甲状腺乳头状癌增殖和侵袭的作用及机制研究研究显示,CUL4B与肿瘤的增殖、侵袭和转移显著相关,提示它可能成为新颖的致癌基因。我们课题组在之前的研究中也证实CUL4B可影响胆管癌、胃癌和前列腺癌的侵袭和预后。本部分以甲状腺细胞系及动物模型为研究对象,讨论了 CUL4B在PTC中发挥的功能及潜在机制,取得了如下结果:1.CUL4B促进甲状腺细胞的增殖:MTS、EdU及平板克隆实验数据显示,沉默CUL4B的表达可下调PTC细胞IHH4的增殖能力、细胞活性及细胞形成克隆的能力;相反,过表达CUL4B可使甲状腺正常滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1和PTC细胞BHP10-3的增殖能力、细胞活性及细胞形成克隆的能力增强。2.CUL4B促进甲状腺细胞的侵袭:细胞划痕、Transwell小室结果显示,沉默CUL4B的表达可下调PTC细胞IHH4的迁移和浸润能力;相反,过表达CUL4B可使甲状腺正常滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1和PTC细胞BHP10-3的迁移和浸润能力增强。3.CUL4B可促进体内肿瘤生长:裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,接种沉默CUL4B表达的IHH4细胞后,肿瘤的生长速度减慢,肿瘤体积和重量显著降低。4.CUL4B可诱导PTC细胞EMT的发生:在IHH4中沉默CUL4B表达后细胞变的更圆,具有上皮形态;相反,在BHP10-3中过表达CUL4B后细胞变长梭,细胞之间变的松散。RT-qPCR及Western-blot实验数据显示,CUL4B表达沉默可引起IHH4细胞的上皮指标E-cadherin表达水平升高,间质指标N-cadherin、Vimentin及转录因子Snail、Slug表达水平明显下降。CUL4B过表达则可使BHP10-3细胞的上皮指标E-cadherin表达下降,而间质指标N-cadherin、Vimentin及转录因子Snail、Slug表达上升。5.CUL4B可能通过正向调控Wnt/β-catenin/c-myc信号通路及PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用:IHH4细胞瞬时干扰CUL4B表达的全基因组表达谱芯片基因探针富集分析(GSEA)显示,差异表达的基因主要富集在Wnt信号通路上。TCGA数据分析显示PTC中CUL4B和Wnt/β-catenin通路关键分子CTNNB1的mRNA水平呈中等程度相关。Western-blot显示在CUL4B表达沉默的IHH4细胞中,Wnt/β-catenin/c-myc信号通路关键分子β3-catenin的总蛋白、核蛋白及下游分子c-myc的水平均显著下调,而在CUL4B过表达的BHP10-3细胞中,β-catenin总蛋白、核蛋白及c-myc的水平均升高。免疫荧光检测显示在IHH4细胞中沉默CUL4B表达后,β-catenin的入核减少。另外,IHH4细胞沉默CUL4B表达后,RT-qPCR及Western-blot显示PI3K/AKT信号通路的拮抗因子PTEN的表达水平上调。TCGA数据分析显示在PTC中CUL4B与PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路关键分子PI3KCA、AKT、mTOR的mRNA水平呈高度相关。Western-blot显示IHH4细胞干扰CUL4B表达后,PI3K/AKT/mTOR信号通路关键分子AKT的总蛋白表达水平无明显改变,但磷酸化蛋白的水平明显下调,下游因子mTOR的总蛋白和磷酸化蛋白水平均下调;在CUL4B过表达的BHP10-3细胞中,AKT总蛋白的水平无明显变化,但磷酸化蛋白水平升高,mTOR的总蛋白和磷酸化蛋白水平均升高。研究结论:1.在体外,CUL4B可促进甲状腺正常滤泡上皮及PTC细胞的增殖、细胞活性、克隆形成、迁移、侵袭及EMT发生;在体内,CUL4B可促进PTC肿瘤生长。2.CUL4B可能通过正向调控Wnt/β-catenin/c-myc信号通路及PTEN/PI3K/AKT/mTOR信号通路,发挥促癌作用。


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