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海洋链霉菌Streptomyces Sp.B59中天然产物的挖掘

刘洋  
【摘要】:链霉菌中的天然产物是药物的主要来源之一。大规模基因组序列分析发现链霉菌能够编码大量不同类型的化合物,还有继续发现具有新型先导结构的化合物的巨大空间。海洋链霉菌因生存环境的特异性,可能蕴涵不同于陆生链霉菌的独特代谢途径,是新颖结构的重要来源,而且资源更为丰富,是近年来的研究热点。最近系统的基因组测序也表明海洋放线菌中有大量独有的未知基因簇有待发现,海洋放线菌仍然是发现新型活性天然产物的最主要来源之一。本实验室人员从威海近海的海泥样品中分离到了一株链霉菌,命名为Streptomyces sp.B59。它的16SrDNA序列比对显示与之最相近是Streptomyces marokkonensis Ap1T和 Streptomyces lusitanus NBR113464CT,相似度均为98.89%。基因组测序及分析发现其含有25个天然产物基因簇,包括9个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和聚酮合酶(PKS)基因簇,其中有6个显示出与已知基因簇具有极低的相似度,也是本试验的研究目标。本试验首先使用传统的OSMAC(One strain-many compounds)方法尝试挖掘B59菌株中的次级代谢产物。选择了七种培养基对B59进行了发酵,经过LC-MS和抗菌活性的检测,最终发现了两类次级代谢产物。第一类是一种对金黄色葡萄球菌有抑制活性的次级代谢产物(B59-2,m/z 828.5),但是化合物不稳定未得到足够的纯品。第二类是一种新型大环多烯内酯类化合物(B59-1,m/z555),其结构通过质谱和核磁共振得到鉴定,并且初步测试其具有抑制稻瘟病孢子萌发的活性,在50 μg/ml浓度下抑制率达到100%。其次,利用直接克隆结合异源表达策略挖掘B59菌株中的沉默基因簇。本试验利用Red/ET重组工程技术直接克隆了 BGC1(87.3 kb),BGC2(56.3 kb),BGC3(34.3 kb),BGC6(38.6kb),BGC21(32.9kb)五个与已知基因簇相似度较低的基因簇,经过合理修饰后并转移到异源宿主中进行表达,其中四个基因簇都成功检测到了相应的天然产物。BGC1是一个酰基转移酶缺失的聚酮合酶(trans-AT PKS)基因簇。根据antiSMASH预测的PKS延伸模块和基因簇内存在的β-branch途径,我们推测它是化合物B59-1的生物合成途径,并决定用异源表达的方法进行验证。经过直接克隆和启动子的添加,BGC1基因簇成功地在天蓝色链霉菌A3(2)和白色链霉菌J1074中得到表达,证明了它是化合物B59-1的生物合成途径。然后,通过修饰基因的过表达和培养基优化,BGC1在白色链霉菌J1074中的产物产量得到了显著地提高,并分离纯化得到6个化合物(2-5mg),正在进行结构解析。BGC2也是一个trans-AT PKS,与Teredinibacter turnerae(海洋中船蛆的共生菌)来源的大环内脂类类化合物Tartrolon的合成基因簇比较相似。Tartrolon类的化合物具有抗细菌,杀虫和细胞毒素的活性。本研究利用组成型启动子替换了基因簇中的调控基因和原有的启动子区域,成功地在J1074中激活了 BGC2基因簇。又经过修饰基因的过表达,BGC2的产物提高了约30倍,并产生了更多的衍生物。化合物分离及结构鉴定正在进行中。BGC6是一个II型的聚酮合酶基因簇,与Xantholipin和TLN-05220基因簇的核心基因比较相似,但修饰基因相差比较大,可能编码一类多环黄酮类抗生素。本研究利用双向启动子替换了基因簇中原有的启动子区域,激活了该基因簇表达,并发现其产物有抗金黄色葡萄球菌的活性。经过分离纯化得到3个纯品(4-6 mg),正在进行结构鉴定。BGC21是一个含有卤化酶的I型PKS基因簇,与已发现的Neocarzilin基因簇很相似。Neocarzilin是一种含氯的多烯类天然产物,对白血病细胞K562有很强的抑制活性。本实验成功地在天蓝色链霉菌A3(2)中异源表达了 BGC21基因簇,并分离到了三个新的化合物,初步生测表明未发现具有细胞毒性。通过进一步的生物信息学分析、基因的敲除及中间产物的结构鉴定,初步确定了 BGC21产物的生物合成途径。综上所述,本研究通过对海洋链霉菌B59菌株中的沉默基因簇挖掘,成功激活了 4个基因簇,并对其产物进行了分离,共分离得到15个化合物,鉴定了 6个化合物的结构,阐释了两类新型化合物(BGC1和BGC21)的生物合成途径。本实验不仅激活了新的天然产物合成途径,也进一步证实了 Red/ET同源重组工程介导的直接克隆和基因修饰在异源表达方面的实用性,为其它放线菌天然产物的挖掘提供了参考。此外,本试验再度证明了海洋链霉菌中仍然具有发现新型天然产物的巨大空间,作为新药的来源。


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