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Nell-1促进牙髓干细胞神经向分化的相关研究

韩琦  
【摘要】:目的:Nell-1(Nel-like molecule-1)在成骨分化和骨再生中起到重要作用。前期研究表明Nell-1可以正向调节成牙本质细胞分化和牙本质的形成。我们研究小组发现,Nell-1可以与神经标记物共表达。本实验的目的是通过体内和体外研究探讨Nell-1蛋白在牙髓细胞神经向分化过程中是否发挥正向调控作用。材料和方法:1.采用免疫荧光双染技术对大鼠牙髓组织切片进行Nell-1与神经标记物P物质(Substance P,SP),巢蛋白(Nestin)的染色,来观察Nell-1在大鼠牙髓组织中的分布及其与牙髓神经的关系。2.建立大鼠牙髓炎模型,将浸有Nell-1蛋白的胶原海绵植入大鼠牙髓腔内,免疫组化染色来观察Nell-1蛋白在炎症环境中对牙髓细胞神经标记物的作用。3.利用组织块酶消化法培养人牙髓细胞。采用单克隆法获得牙髓干细胞。采用流式细胞术来检测干细胞表面标记物。成骨诱导液诱导,茜素红染色来观察牙髓干细胞成骨分化能力。成脂诱导液诱导,油红O染色观察牙髓干细胞成脂分化能力。神经诱导液诱导人牙髓干细胞,采用免疫细胞化学染色观察细胞形态改变及相关神经标记物变化。4.将人牙髓干细胞分别与0、50、75、100、125ng/mL的Nell-1蛋白共培养12h、24h、72h。利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测神经相关基因(Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-LⅡ微管蛋白(β-LⅡtubulin))在mRNA水平上的表达,Western Blot技术检测(Nestin、GFAP)基因在蛋白水平上的表达。初步探索Nell-1蛋白对人牙髓干细胞神经向分化的调控作用并确定Nell-1蛋白的最佳有效浓度。结果:1.免疫荧光染色发现,Nell-1在正常牙髓组织中有大量表达,并且与神经标记物SP,Nestin共表达。2.在大鼠牙髓炎模型中,Nell-1组大鼠牙髓细胞神经标记物SP,NSE,Nestin表达呈强阳性。3.利用组织块酶消化法成功培养出了人牙髓原代细胞。单克隆法获得牙髓干细胞。流式细胞仪检测牙髓干细胞表面标记物,CD90、CD44阳性,CD34、CD45阴性。茜素红染色后在显微镜下观察成骨诱导14天,有明显矿化结节形成,油红O染色后在显微镜下观察成脂诱导21天细胞内有桔红色脂滴。细胞免疫组织化学染色在显微镜下观察成神经诱导后4天细胞形态发生明显改变,呈现长突触多边形形态并且相关神经标记物GFAP、NSE表达强阳性。4.人牙髓干细胞与Nell-1蛋白共培养12h,24h,72h后,Nell-1蛋白浓度在100 ng/mL时神经相关基因Nestin,β-Ⅲ tubulin,GFAP mRNA表达量最高。相关基因GFAP,Nestin蛋白表达量较高。结论:1.Nell-1在大鼠牙髓神经中表达,Nell-1蛋白刺激能够促进大鼠牙髓干细胞表面神经标记物表达量升高。2.组织块酶消化法培养人牙髓细胞高效且状态佳。成骨,成脂,成神经向分化实验证明单克隆培养的牙髓干细胞具有多向分化潜能。流式细胞术证明牙髓干细胞为间充质干细胞。3.Nell-1蛋白在体外与人牙髓干细胞共培养,能够刺激人牙髓干细胞表面神经因子表达量增加。


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