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基于原噬菌体重组酶的乳酸菌基因组编辑技术的建立及其应用

辛永平  
【摘要】:乳酸菌应用于食品发酵领域具有悠久历史,它产生有机酸、维生素、多糖等高附加值化合物,赋予产品特殊的风味、质地和保质期。最近发现,一些乳酸菌也对人体有益生作用。干酪乳杆菌作为乳酸菌,是一种重要的工业微生物,广泛应用于乳制品发酵领域。目前,基因组测序技术及功能基因组学的发展为干酪乳杆菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造,合成生物学的发展提供了理论基础。然而,干酪乳杆菌的基因组编辑主要采用同源双交换的方法,这种方法效率低下,耗时且操作烦琐,阻碍了上述课题的研究进程。此外,干酪乳杆菌也可以作为理想的细胞工厂表达抗原,生物活性分子以及一些酶类。但是,干酪乳杆菌作为细胞工厂还存在很多亟需解决的问题,例如,无法实现高效地程序化精简基因组,以便构建最适细胞工厂;无法以染色体整合的形式表达足量的重组蛋白,解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题;无法高效筛选原噬菌体删除株,避免原噬菌体在发酵过程中被各种胁迫诱导脱离染色体导致发酵流产。本文主要以干酪乳杆菌为宿主,围绕建立基因组编辑工具以解决干酪乳杆菌在上述各个领域中遇到的问题展开研究。首先,生物信息学分析并体内验证了原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的功能,以此为基础建立了基于双质粒和单质粒的基因敲除、插入及定点突变的工具,分别解决了乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造效率低下的问题;其次,结合原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统建立了大片段基因组DNA的敲除及靶向多拷贝的基因组整合工具,分别为精简基因组构建最适细胞工厂及以染色体的方式过量表达外源蛋白提供了有效手段:最后,进一步研究了 CRISPR/Cas9系统在干酪乳杆菌中的功能,并利用其筛选到一系列原噬菌体删除株,研究了原噬菌体删除株作为细胞工厂在工业发酵中的应用潜力。此外,还在乳酸乳球菌中建立了一套反向筛选系统用于基因的无痕敲除。具体研究内容和结果如下:1.干酪乳杆菌原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60的挖掘及其在基因组编辑中的应用基因组编辑是挖掘新功能基因和代谢途径改造所必需的。然而,干酪乳杆菌基因组编辑效率低下,操作繁琐。本文利用生物信息学的方法,在干酪乳杆菌BL23原噬菌体PLE3的基因组上鉴定到一个与λRed操纵子类似的原噬菌体重组酶操纵子LCABL_13040-50-60。体内重组实验证明原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60能够介导外源线性双链DNA片段与染色体上的同源序列之间发生同源重组反应,成功地将干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因片段替换为氯霉素抗性基因(cat)。此外,通过比较不同组合蛋白质介导同源重组的效率,结果表明LCABL_13040和LCABL_13060分别是宿主核酸酶抑制因子(Redγ)和5'-3'核酸外切酶(Redα/RecE)的类似物。通过优化重组实验的条件(诱导剂的终浓度以及添加诱导剂时的OD600值;同源臂的长度;复苏时间;线性双链DNA的量),使同源重组效率得到显著提高,达到~2.2×10-7。随后,将原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60与Cre/loxP系统结合,实现了干酪乳杆菌BL23染色体上长为167 bp的galK基因内部片段的无缝敲除,gfp基因的无缝插入以及rpoB基因的点突变。此外,证明了在宿主核酸酶抑制因子(Redy)的辅助下,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60在其它6株具有转化能力的干酪乳杆菌菌株,副干酪乳杆菌OY以及植物乳杆菌WCFS1中也具有催化同源重组的功能。这些结果表明,原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60具有在其它乳酸菌中进行基因组编辑的潜能,为乳酸菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造及合成生物学的发展提供了有效手段。2.基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60的单质粒基因组编辑系统的构建及其在代谢工程中的应用第一部分建立的基于双质粒的基因组编辑系统虽然高效,但是,在代谢工程中对多个基因进行有序删除时仍然耗时较长。本文在干酪乳杆菌中建立了一个基于单质粒的简便快速的基因组编辑工具,并利用其对干酪乳杆菌进行代谢工程改造,成功提高了乙偶姻的产量。首先,构建质粒pMSP456-Cre,原噬菌体重组酶基因LC4BL_13040-50-60的转录由nisin诱导表达系统(NICE)来控制,位点特异性重组酶基因cre的转录由干酪乳杆菌BL23乳糖操纵子的启动子来控制。为了验证这一单质粒基因组编辑系统的有效性,利用质粒pMSP456-Cre对hicD3基因进行敲除。首先,LCABL 13040-50-60 催化线性双链 DNA(up-lox66-cat-lox71-down)的同源臂与染色体上的同源序列间发生同源重组反应,将hicD3基因替换为lox66-cat-lox71,然后,Cre位点特异性重组酶介导cat基因的切除,效率为60%。为了验证该系统能否实现干酪乳杆菌基因的有序删除,将与合成乙偶姻副产物相关的三个基因(pflB,ldh和pdhC)进行连续的敲除,效率分别为60%,40%和60%。最终获得四个基因的敲除株在摇动条件下能够将59.8%的葡萄糖转化为乙偶姻,乙偶姻的产量约为野生株的18倍。这些结果表明本文为干酪乳杆菌基因组编辑提供了一种简单快捷的方法,可以应用于代谢工程改造干酪乳杆菌高产高附加值代谢产物。3.结合LCABL 13040-50-60和Cre/loxP系统敲除干酪乳杆菌大片段基因组DNA近年来,精简基因组构建最适细胞工厂受到广泛的关注。但是,前两部分内容构建的基因组敲除工具在敲除大片段基因组DNA时效率低下,无法快速高效地精简干酪乳杆菌基因组。本文在干酪乳杆菌BL23中构建了一个基于原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60和Cre/loxP位点特异性重组系统的基因组敲除工具。原噬菌体重组酶LCABL 13040-50-60用来介导目的片段5'和3'端突变loxP(lox66和lox71)位点的插入。随后,Cre位点特异性重组酶介导目的片段的删除。利用这一工具,成功敲除了干酪乳杆菌BL23染色体上一个长达~39.3 kb的非必需片段,一个长~12.8 kb且对细胞生长有影响的片段,以及同时敲除染色体上两个不连续的目的片段(5.2 kb和6.6 kb),效率都为100%。此外,为了验证这一工具能否用于多个DNA片段敲除株的构建,在干酪乳杆菌BL23染色体上有序删除了两个DNA片段(长度约占全基因组的1.68%)。最后,对获得突变株的生物学特性(包括生长速率,电转效率,细胞形态以及外源蛋白的表达量)进行研究。据我们所知,这是首次在干酪乳杆菌中实现大片段基因组DNA的有序删除。这一高效低成本的大片段DNA敲除工具可以加快精简基因组的步伐,以便更快地实现程序化构建干酪乳杆菌工程菌株作为最适细胞工厂高产高附加值产物。4.干酪乳杆菌中靶向多拷贝基因组整合工具的建立及其在提高重组蛋白表达中的应用微生物细胞工厂以染色体的形式表达重组蛋白可以解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题。然而,在利用现有的染色体整合方法构建的干酪乳杆菌菌株中,重组蛋白的表达量不足以应用于实际生产中。本文在干酪乳杆菌中建立了一个两步法的靶向多拷贝基因组整合系统。此整合系统基于原噬菌体重组酶LCABL_13040-50-60和Cre/loxP系统,能够实现外源基因整合到染色体上,效率达到~3.7×103 CFU/μg DNA。利用此系统将单拷贝的gfp基因分别整合到染色体上均匀分布的六个位点,构建的六个整合株的相对荧光强度(RFUs)最大相差约3.7倍,其中,单拷贝gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株的相对荧光强度(RFU)最大。此外,随机选取gfp基因插入位点LCABL_07270的整合株,发现它们的相对荧光强度(RFUs)的范围为993±89到7,289±564,对应的gfp基因的相对拷贝数为1到13.68±1.08。此外,经过63代的无选择压力培养,13.68±1.08个gfp拷贝的菌株中GFP蛋白的表达比以质粒方式表达GFP蛋白的菌株稳定性要高。为了进一步验证此系统能否用于生物活性分子的高表达,利用此系统成功将5.51±0.25个拷贝的大肠杆菌菌毛黏附素基因faeG插入到位点LCABL_07270中并实现稳定表达。这些结果表明,此整合系统可以通过定向多拷贝的基因整合实现重组蛋白高效、稳定地表达,为乳杆菌作为细胞工厂以染色体的方式表达外源蛋白提供了有效的手段。5.利用CRISPR/Cas9系统筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株筛选干酪乳杆菌原噬菌体删除株作为细胞工厂应用于工业发酵中可以避免原噬菌体脱离染色体导致发酵流产。然而,以目前的手段无法高效筛选原噬菌体删除株。本文利用酿脓链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统筛选到几株原噬菌体删除的菌株,并研究了原噬菌体删除株在胁迫环境中的存活率。首先,分别将打靶染色体上的galK基因和质粒pNZ8148上的氯霉素抗性基因cat的质粒电转化菌株L.casei BL23和L.casei BL23/pNZ8148,发现转化效率明显低于非打靶质粒,表明CRISPR/Cas9系统可以切割干酪乳杆菌BL23中的双链DNA,杀死细胞。随后,通过分别转化打靶原噬菌体PLE1,PLE2和PLE3的打靶质粒,成功筛选到三个原噬菌体独立删除的突变株(L.casei BLP1,BLP2和BLP3)。最后,以突变株为出发菌株,有序地筛选到三个原噬菌体全部删除的菌株L.casei BLP1 23。通过比较这些突变株与野生株在不同胁迫环境下的存活率,发现原噬菌体删除株L.casei BLP1 23在大部分胁迫环境中的存活率都与野生株几乎没有差异,表明原噬菌体删除株L.casei BLP1 23具有作为细胞工厂应用于工业发酵中的潜力。6.乳酸菌中反向筛选系统的建立及其应用如今,乳酸菌的遗传改造工具还是基于条件型复制质粒的同源双交换的方法,这些方法操作繁琐,效率低下。为了解决这一问题,研究者开发了一系列的反向筛选标记,但是这些反向筛选标记大部分不能直接应用于野生型菌株。本文在乳酸乳球菌NZ9000中鉴定到一个编码苯丙氨酸tRNA合成酶α亚基的基因pheS。当在质粒上利用乳酸乳球菌NZ9000乳酸脱氢酶的启动子(Pldh)控制突变的pheS基因(pheS*)的转录时,表达的PheS*(A312G)蛋白足以使宿主细胞对苯丙氨酸的类似物对氯苯丙氨酸(p-C1-Phe)敏感,结果表明pheS*可以在乳酸乳球菌NZ9000中作为一个反向筛选标记。但是,当将Pldh-pheS插入到染色体上,PheS*(A312G)蛋白的表达量不足,导致宿主细胞对p-Cl-Phe的敏感性降低。因此,本文选用串联启动子的方法来提高PheS*(A312G)蛋白的表达量。结果表明,串联5个启动子Pldh后(5Pldh-pheS*),PheS*(A312G)蛋白的表达量便足以使宿主细胞对15 mM p-Cl-Phe敏感。随后,将反向筛选标记5Pldh-pheS*插入到温度敏感型质粒pG+host9,在乳酸乳球菌NZ9000中建立了一个无痕的基因组编辑系统PheS*/pG+host9。此外,本文也验证了pheS*作为反向筛选标记在干酪乳杆菌BL23中的可行性。这些结果表明,pheS*作为反向筛选标记可以在乳酸乳球菌NZ9000中实现目的基因的无痕删除,并且具有在干酪乳杆菌BL23中的应用潜力。此外,这一高效且省时的无痕基因组编辑系统PheS*/pG+host9具有应用于其它乳酸菌的潜力,为乳酸菌代谢工程及合成生物学的发展提供了有效手段。


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