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子宫内膜癌DNA错配修复基因表达与顺铂敏感性相关性研究

李越  
【摘要】:子宫内膜癌是我国常见的女性生殖器官来源的恶性肿瘤,每年的发病率大约为22.7/10万,近年来,其发病率逐年上升。但是关于子宫内膜癌疾病的具体发病机制却没有统一的认识,目前大多数学者认为该疾病的发生和发展是多因素作用、多基因参与的过程。在合并有遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer,HNPCC)综合征的女性患者中,子宫内膜癌的累积终生风险率为40%至60%,子宫内膜癌常常是患有Lynch综合征的女性患者中最早发病的肿瘤之一,这类子宫内膜癌也被称为Lynch综合征相关性子宫内膜癌(Lynch syndrome related endometrial carcinoma,LS-EC)。这类疾病的主要特征是发生了错配修复(Mismatch Repair,MMR)基因的缺失或失活,具有遗传易感性。MMR基因是在遗传性非息肉性结直肠癌(Hereditary Non-polyposis Colorectal Cancer,HNPCC)中分离到的一组遗传易感性基因,MMR基因的表达与Lynch综合征相关性子宫内膜癌患者的预后及疾病预防有密切相关性,针对M M R基因的检测是筛查Ly n c h综合症相关性子宫内膜癌人群的有效方法之一,早期MMR基因的筛查对Lynch综合征及其近亲患者的早期诊断及术后辅助治疗非常重要。顺铂是广泛应用于临床的一线抗癌药物,在多种类型的恶性肿瘤的治疗中均能达到很好的治疗效果,当顺铂药物作用于肿瘤细胞时,细胞内的DNA会与顺铂相结合并与之产生交联,使DNA的空间结构发生改变,使其功能丧失,并且能够阻止细胞的有丝分裂,是一种非特异性抗肿瘤药物,但是近几年,随着越来越多种类的肿瘤细胞对顺铂药物出现耐药性,顺铂的临床应用受到很大限制。耐药性的产生是多方面的,目前认为主要是与DNA修复能力的增强,P53基因的突变及DNA错配修复能力缺陷有关。MMR基因主要功能是在复制后水平及时识别和修正错误,从而保持DNA复制的完整性,其中的任一基因发生突变,都可能会导致错配修复功能发生缺陷,最终导致肿瘤发生。然而,MMR基因在子宫内膜癌中的具体作用机制尚未得到充分研究。在本研究中,应用实时定量PCR(RT-PCR)及Western蛋白印迹等技术检测Ishikawa和RL95-2中错配修复基因MLH1、PMS2、MSH6的表达水平,在相同浓度的顺铂作用下,应用CCK8细胞增殖-毒性实验检测Ishikawa及RL95-2细胞对顺铂的药物敏感性。此外,本研究通过特异性的上调或下调子宫内膜癌细胞中MLH1的表达水平,观察经不同处理的Ishikawa或IL95-2细胞对顺铂药物敏感性的变化,进一步深入探讨顺铂耐药性产生的潜在作用机制,同时建立子宫内膜癌的裸鼠动物模型实验进一步验证,研究表明错配修复基因的检测可能具有预后预测价值,而且,MLH1可能是子宫内膜癌术后辅助治疗的一个全新的靶点,此外,这项研究为子宫内膜癌患者制定个体化治疗方案及实现基因靶向治疗的可能提供了理论依据。第一部分子宫内膜癌细胞中错配修复基因表达与顺铂敏感性的相关性研究目的:1.通过实时定量PCR及Western蛋白印迹检测子宫内膜癌细胞Ishikawa和R L95-2中MLH1、PMS2和MSH6在蛋白及基因水平的表达情况。2.通过CCK8细胞增殖-毒性实验和流式细胞术检测Ishikawa和RL95-2细胞对顺铂药物的敏感性。研究方法:1.应用 RT-PCR 检测 Ishikawa 和 RL95-2 细胞中 MLH1、PMS2、MSH6 的基因表达水平。2.应用 Western blot 法检测 Ishikawa 和 RL95-2 细胞中 MLH1、PMS2、MSH 6的蛋白表达水平。3.CCK8细胞增殖-毒性实验检测不同浓度顺铂处理的Ishikawa和RL95-2细胞活性,应用流式细胞术检测不同浓度顺铂处理后的Ishikawa和RL95-2细胞的凋亡率。研究子宫内膜癌细胞系Ishikawa和RL95-2对不同浓度顺铂药物的敏感性与错配修复基因表达之间的关系。4.应用GraphPad Prism 6.01版进行统计学分析。使用Student's t检验分析两组或三组之间的差异。P值0.05具有统计学意义。研究结果:1.RL95-2 细胞中 MLHI,PMS2,MSH6 呈高表达,Ishikawa 细胞中 MLH1,PMS 2,MSH6呈低表达,二者中MLH1、PMS2、MSH6的表达水平有显著差异,这种差异有统计学意义(P0.05)。2.CCK8细胞增殖-毒性实验检测到在相同的0,5,10,15,20,25umol顺铂化疗药物浓度梯度下Ishikawa和RL95-2细胞对顺铂的IC50值分别为2.5umol和82.6umol/ml(P0.05)。二者间的差异有统计学意义,与Ishikawa相比,RL95-2细胞对顺铂药物的敏感性更高。3.应用流式细胞仪检测Ishikawa和RL95-2细胞在无顺铂诱导下培养72h时细胞的凋亡率,无顺铂作用下RL95-2细胞凋亡率为15.61%,Ishikawa为13.32%,二者差异无明显意义(P0.05).加入5umol的顺铂药物72小时后检测到RL95-2细胞的凋亡率为51.18%,Ishikawa细胞的凋亡率为18.79%(P0.05).二者差异显著,有统计学意义。结果表明在相同顺铂浓度作用下,与Ishikawa细胞相比,高表达错配修复基因的RL95-2细胞对顺铂更为敏感,细胞凋亡率更高。研究结论:1.MLH1,PMS2,MSH6在RL95-2细胞中呈现基因及蛋白水平的高表达,在I shikawa细胞中则为基因和蛋白水平的低表达。2.在相同的顺铂浓度梯度作用下Ishikawa和RL95-2细胞的活性和凋亡率存在显著差异,RL95-2细胞对顺铂更为敏感,细胞凋亡率更高,结果表明,M LH1,PMS2,MSH6表达的水平可能会影响子宫内膜癌对顺铂的敏感性。第二部分MLH1通过激活MLHl/c-Abl信号通路增强子宫内膜癌对顺铂的敏感性研究目的:1.上调或下调Ishikawa和/或RL95-2中的MLH1的表达,分别于处理前后检测Ishikawa和RL95-2细胞的顺铂敏感性的变化。2.应用Western blotting方法深入研究MLH1在子宫内膜癌中的潜在作用机制,进一步验证MLHl/c-Abl信号传导通路在增强子宫内癌顺铂敏感性方面的具体参与机制。3.应用CCK8细胞增殖-毒性实验、细胞凋亡的检测、Hoechst33258荧光染色分析不同处理前后Ishikawa和RL95-2细胞功能方面发生的变化,建立动物模型实验进一步验证MLH1与顺铂敏感性的关系。研究方法:1.设计并合成不同的针对于MLH1的siRNA片段,并成功转染至RL95-2中,选择效果最优的siRNA片段特异性下调RL95-2中MLH1的表达。2.构建腺病毒载体即ADV-MLH1,成功感染Ishikawa,特异性上调Ishikawa中的MLH1。3.采用CCK8细胞增殖-毒性实验、流式细胞学检测及hoechst33258免疫荧光染色技术检测Ishikawa和RL95-2经过不同处理后顺铂敏感性发生的变化。4.Western blot方法检测MLH1/c-Abl凋亡信号通路中信号蛋白c-Abl,bd-2,caspase-9,caspase-3和PARP在顺柏作用下的Ishikawa和IL95-2中的表达5.建立裸鼠模型实验,ADV-MLH1特异性上调Ishikawa中MLH1的表达,进一步验证了Ishikawa在上调MLH1的表达后对顺铀敏感性的变化情况。6.统计学方法同第一部分。研究结果:1.本研究共选择了MLH1的4个位点设计合成MLHl-siRNA,并分别转染至R L95-2中,通过RT-PCR及Western blot验证了各组的干扰效果,证实siRN A-1832的干扰效果最佳,干扰率达到了80%以上。2.成功构建特异性MLH1腺病毒载体(ADV-MLH1),并成功感染Ishikawa,RT-PCR及Western blot验证了其特异性上调MLH1的效果,证实MLH1的上调效果达到了80%-90%。3.将MLHl-siRNA-1832成功转染至RL95-2中,CCK8细胞增殖-毒性实验结果发现特异性下调MLH1的表达后,与对照组相比,在药物作用72小时时,实验组顺柏药物的IC50值由2.5umol/mL上升至15umol/mL,细胞活性明显增高,细胞毒性显著下降(P0.05)。细胞凋亡实验结果:实验组(siMLHl+CDDP)的细胞凋亡率为12.9%,阴性对照组(siMLHl-NC+CDDP)细胞凋亡率为36.9%;空白对照组(RL95-2+CDDP)细胞凋亡率为48.3%,结果显示,与RL95-2+CDDP和siMLHl-NC+CDDP组相比,siMLHl+CDDP组细胞的凋亡率显著下降(P0.05)。hoechst33258免疫荧光染色结果显示:siML H1+CDDP组的凋亡小体比RL95-2+CDDP和siMLH 1-NC+CDDP组的凋亡小体明显减少,siMLHl+CDDP组细胞的凋亡率较对照组明显下降,二者差异有统计学意义(PO.05)。4.将特异性腺病毒载体ADV-MLH1感染Ishikawa细胞,CCK8细胞增殖-毒性检测结果显示特异性上调MLH1后,与对照组相比,在给药后72小时,MLH1上调组细胞顺铀的IC50值由82.6umol/mL下降至12.5umol/mL,细胞活性明显下降,细胞毒性显著增加(P0.05)。MLH1上调实验中Ishikawa细胞凋亡检测结果:实验组(ADV-MLH1+CDDP)的细胞凋亡率为28.3%,阴性对照组(ADV_NC+CDDP)细胞的凋亡率为15.4%;空白对照组(Ishikaw a+CDDP)组细胞的凋亡率为18.8%,结果显示,与ADV-NC+CDDP组和Is hikawa+CDDP相比,ADV-MLH1+CDDP组的细胞凋亡率明显升高(P0.05)。hoechst33258免疫荧光染色后,在荧光显微镜下可见实验组与对照组相比,ADV-MLH1+CDDP组的凋亡小体较对照组明显增多(P0.05),二者差异有统计学意义(P0.05)。5在上调MLH1的Ishikawa中检测到c-Abl蛋白的表达增加,通过光密度测定法分析显示,与对照组相比,在顺铂药物分别作用48和72小时,在ML HI上调的Ishikawa细胞中检测出c-Abl蛋白分别增加了1.6倍和2.0倍(P0.05);Cleaved caspase-3增加了2.3倍和2.5倍(P0.05)。Cleaved PA RP在顺铂药物诱导48小时增加了1.68倍(P0.05),在顺铂持续作用72小时时增加了2.2倍(P0.05)。Bcl-2蛋白显示出随着顺铂诱导时间的延长而出现逐渐减少的趋势。当特异性下调RL95-2细胞中MLH1的表达时,以上通路蛋白的表达水平呈现出相反的趋势。6.建立裸鼠模型实验,进一步研究MLH1对顺钼诱导的裸鼠肿瘤生长的影响。结果发现,ADV-NC对照组的肿瘤体积在实验30天时增加至763土11.2.0 m m3,而ADV-MLH1实验组的肿瘤体积为203.6±8.7 mm3,实验组肿瘤体积明显小于对照组。二者差异有统计学意义(P0.05)。研究结论:1.上调MLH1的表达可显著提高Ishikawa对顺铂的敏感性;下调MLH1的表达可显著降低RL95-2对顺铂的敏感性。2.MLH1可能是通过激活MLH1/c-Abl信号传导通路从而增强子宫内膜癌对顺怕的敏感性。3.MLH1在子宫内膜癌中的表达可能在促进顺钼诱导的细胞凋亡方面起到重要作用。这种作用机制的发现更有利于进一步了解和探讨子宫内膜癌的发生,MLH1可能是子宫内膜癌治疗的新靶点,需要更进一步深入的研究。


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