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大肠杆菌中OxyR对活性硫烷硫的调控以及异养细菌氧化硫化氢的应用研究

侯宁可  
【摘要】:硫是组成生命体的重要元素之一,早在地球上生命进化的初期,硫元素尤其是还原态硫在环境中就普遍存在,并且在生命起源中起到了非常重要的作用。时至今日,随着地球生态环境的变迁,虽然大多数环境中硫元素已没有那么普遍,只在少数的特殊环境例如热泉、火山口等环境存在大量硫元素,但它在生物体内仍然行使着重要的生理功能。活性硫烷硫就是近年发现的在生物体内普遍存在的活性分子。活性硫烷硫包括无机多硫化物(H2Sn,n≥2),有机多硫化物(RSSnH,RSSnR,n≥2)以及有机过硫化物(RSSH)。它们同时具有亲核性和亲电子性,而含巯基化合物(半胱氨酸、GSH等)一般是亲核的。作为亲核物质,活性硫烷硫(如GSSH)的亲核性要远大于对应的含巯基化合物(如GSH)的亲核性;作为亲电子物质,它们将自身的硫烷硫(S0)转移到蛋白巯基上形成过硫化修饰,影响蛋白质的活性,并且保护蛋白巯基免受不可逆的氧化。基于这种双重的反应活性,活性硫烷硫参与胞内氧化还原稳态的调节以及细胞信号传递。然而,高浓度的硫烷硫对细胞具有毒性。事实上硫一直被用作抗真菌剂。尽管它的毒性机制尚不清楚,但是最近的研究表明硫是以无机多硫化物的形式被转移到了胞内,它的毒性机制可能是由于这些无机多硫化物对胞内蛋白质进行了过硫化修饰。有机含硫化合物可以利用催化剂转化成无机多硫化物,用作抗细菌药物抑制细菌感染。无论细菌还是真菌的正常生长都受外源硫烷硫压力的影响,因此,微生物可能需要一种调控机制将胞内的硫烷硫保持在一定的浓度范围内。目前已经发现了多个硫烷硫的内源产生途径。三巯基丙酮酸转移酶和半胱氨酰tRNA合成酶可以利用半胱氨酸为底物合成硫烷硫。另外,胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶可以催化胱氨酸产生半胱氨酸过硫化物(Cys-SSH),但考虑到胞内胱氨酸浓度并不高,这两个酶是否能在体内产生硫烷硫仍然存在争议。硫醌氧化还原酶(SQR)以及超氧化物歧化酶(SOD)可以氧化硫化氢产生硫烷硫。大多数的微生物含有一条或多条上述途径。目前发现了两条活性硫烷硫的去除途径。好氧条件下微生物可以利用过硫化物双加氧酶将GSSH氧化成亚硫酸盐,而且在一部分细菌中过硫化物双加氧酶受到可以感应硫烷硫的转录因子的调控。活性硫烷硫还可以被还原成硫化氢。谷氧还蛋白(Grx)和硫氧还蛋白(Trx)之前被认为用于还原细胞遭受氧化压力后形成的蛋白质二硫键,最近的研究发现它们也可以催化活性硫烷硫还原成硫化氢,并且比GSH具有更强的活性。然而,目前还没有报道硫烷硫是否可以诱导谷氧还蛋白和硫氧还蛋白的表达。大肠杆菌中不含有硫烷硫的氧化途径,但是含有三个硫氧还蛋白和四个谷氧还蛋白,其中TrxC以及GrxA的表达受到一个全局性转录调控因子OxyR的调控。OxyR最初被鉴定为响应活性氧(ROS)的调控因子。ROS将OxyR蛋白的Cys199和Cys208之间的巯基氧化成二硫键或者将Cys199氧化成C199-SOH,确切的机制还存在争论。本文主要以大肠杆菌为研究对象,研究了大肠杆菌中胞内硫烷硫水平的变化,OxyR感应、调控胞内硫烷硫以及外源活性硫烷硫压力的机制;另外还研究了其他含有硫醌氧化还原酶和过硫化物双加氧酶的异养细菌应用于硫化氢生物治理的潜力。主要内容如下:1.活性硫烷硫在大肠杆菌中的积累和还原利用还原剂将大肠杆菌胞内硫烷硫还原为硫化氢,然后用测定硫化氢的显色液测定硫化氢的量,从而标定出大肠杆菌胞内硫烷硫的浓度,我们测得在LB培养基中生长至稳定期的大肠杆菌胞内硫烷硫浓度为800.5±80.3 μM。SSP4是特异性检测硫烷硫的荧光探针,利用SSP4表征大肠杆菌在LB培养基中生长时胞内硫烷硫浓度的变化,发现大肠杆菌在LB培养基中生长时,胞内的硫烷硫浓度会在对数中期开始累积,在稳定期达到最高。当把稳定期的含有较高硫烷硫水平的大肠杆菌细胞接种入新鲜的LB培养基中,在延滞期胞内积累的硫烷硫水平会迅速下降,同时伴随着硫化氢的释放。通过以上结果可以推测大肠杆菌可能是依靠体内的还原系统将硫烷硫还原为硫化氢,释放到胞外。如上所述,大肠杆菌不含有硫烷硫氧化途径,但它含有多个硫氧还蛋白和谷氧还蛋白,当我们在大肠杆菌中分别过表达谷氧还蛋白时,大肠杆菌胞内硫烷硫的浓度得到了部分的下降;当在胞内同时过表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶时,相对于没有过表达蛋白的大肠杆菌对照组,过表达硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶的大肠杆菌胞内在整个生长过程中甚至不会积累硫烷硫。说明大肠杆菌的硫氧还蛋白系统和谷氧还蛋白系统参与大肠杆菌胞内硫烷硫的还原。根据之前的报道,转录调控因子OxyR控制着部分硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的表达,它负责感应过氧化物压力然后激活TrxC和GrxA的转录,同时过氧化物酶KatG也受到OxyR的诱导表达,一直以来,这三个酶被认为是用于应对氧化压力的酶。TrxC和GrxA可以还原氧化压力造成的蛋白二硫键,KatG则可以直接催化双氧水的歧化反应生成水和氧气。但最近的研究表明这三个酶都可以作用于活性硫烷硫,因TrxC和GrxA可以还原小分子无机多硫化物以及过硫化物,KatG则具有氧化无机多硫化物的活性。因此控制它们表达的OxyR在调控胞内硫烷硫水平上可能会起到作用。基于上述假设,我们敲除了大肠杆菌的OxyR基因,观察到敲除株(△oxyR)在对数期的内源硫烷硫含量明显高于野生型(wt)。另外,当把处于稳定期的△oxyR细胞转移到新鲜培养基中后,其胞内硫烷硫含量没有像wt那样出现快速下降的现象,释放到培养基中的硫化氢也不如wt高。△oxyR内源硫烷硫水平的升高以及其对硫烷硫还原力的下降印证了我们的假设。生长压力实验表明,不论在好氧条件还是厌氧条件下,面对外源的活性硫烷硫压力,△oxyR都相比于wt更加敏感。当在△oxyR中用质粒回补一个野生型OxyR后(△oxyR::oxyR),其生长表型又得到了恢复。说明OxyR在应对胞外的活性硫烷硫压力方面具有不可或缺的作用。以上一系列结果指向一个可能性,即OxyR可能通过感应硫烷硫的变化来调控硫氧还蛋白和谷氧还蛋白的表达。2.OxyR调控硫烷硫水平的机理为了验证上述假设,我们分别构建了三个trxC、grxA或katG启动子控制红色荧光蛋白的报告质粒并转入大肠杆菌wt或大肠杆菌△oxyR中。结果表明对于wt,外源添加H2Sn可以诱导TrxC、GrxA和KatG的表达;而在△oxyR中,添加或者不添加外源H2Sn这三个基因都处在一个较低的表达量,H2Sn失去了诱导效应;而当回补一个野生型OxyR到△oxyR中后,H2Sn的诱导效应又得到了恢复。这说明H2Sn正是通过OxyR诱导了trxC、grxA以及katG这三个活性硫烷硫代谢基因的表达。这种OxyR依赖的H2Sn诱导效应不论在好氧条件和厌氧条件下都存在。同时我们证明外源加入硫化氢不能诱导trxC、grxA以及katG的表达,这排除了我们配制的无机多硫化物中含有的微量硫化氢可能对结果的影响。当在大肠杆菌中表达可以氧化硫化氢为无机多硫化物的硫醌氧化还原酶时,硫化氢则可以诱导trxC、grxA以及katG的表达。OxyR的调控区含有两个可以感应过氧化物的半胱氨酸残基,Cys199和Cys208。为了研究OxyR感应活性硫烷硫的机理,我们分别在质粒上将OxyR上的Cys199和Cys208单独或者同时突变为丝氨酸(Ser),形成了 OxyRC199s、OxyRC208S 单突变和 OxyRC199S;C208S 双突变。结果表明 OxyRC199S、OxyRC208S 和OxyRC199S;C208s都失去了正常OxyR的调节功能,说明这两个氨基酸残基都与OxyR感应活性硫烷硫有关。体外翻译实验的结果表明相比于还原态的OxyR,与H2Sn反应的OxyR具有5倍以上的转录活性,证实OxyR可以直接和H2Sn反应而被激活。同时体外翻译结果也证实OxyRC199S、OxyRC208S和OxyRC199S;C208S突变蛋白不能被H2Sn激活,失去了其调控作用,再一次说明了 Cys199和Cys208在感应H2Sn上不可或缺的作用。我们对和H2Sn反应的OxyR进行了质谱分析,结果表明OxyR上的Cys199被H2Sn修饰形成了过硫化修饰(OxyR-SSH),Cys208则没有被修饰。以上结果表明OxyR感应H2Sn的机制是通过在其Cys199上形成一个过硫化修饰(OxyR-SSH),进而激活OxyR启动下游基因的转录。尽管体内和体外的诱导结果显示Cys208也有非常重要的作用,但质谱结果显示它并没有和Cys199形成二硫键或者多硫键-Sn-(n≥3),我们推测它可能对于稳定Cys199的过硫化修饰具有重要作用。3.OxyR相关的蛋白质组、转录组以及生物信息学分析活性硫烷硫发挥信号作用的方式是对多种蛋白质进行过硫化修饰,影响蛋白质的活性。敲除oxyR导致胞内活性硫烷硫水平升高,因此我们应用生物素标签的方法比较了△oxyR和wt胞内的蛋白质过硫化修饰的水平和种类。结果表明△oxyR中过硫化修饰蛋白含量比wt中更高;在种类方面,在wt中检测到66种过硫化修饰的蛋白,而△oxyR中含有118种过硫化修饰蛋白,它们之间有51个蛋白是共有的,15个蛋白是wt特有的,而67个蛋白只在△oxyR能检测到,不存在于wt中。通过GO富集分析(Gene ontology analysis)对wt和△oxyR中过硫化修饰蛋白进行聚类分析,发现 biological process,cellular component 和 molecular function中都含有过硫化修饰的蛋白,尤以能量代谢相关的酶居多。wt和△oxyR二者在过硫化修饰蛋白种类上的区别有可能会对细胞的生理过程造成广泛的影响。OxyR是一个全局性的转录调控因子,它最早被发现可以感应氧化压力的变化,而我们发现它也可以感应活性硫烷硫,因此,我们利用RNA Seq的方法研究了大肠杆菌在面对H2Sn压力和H202压力时的全局转录响应有何异同。全局水平上大肠杆菌面对H2Sn压力和H202压力的响应是不同的。对于硫烷硫产生酶和降解酶(有部分也是H2O:降解酶),大肠杆菌面对二者压力时的响应既有相同也有不同。对于受OxyR调控的蛋白,二者存在上调程度上的不同,体现了 OxyR面对不同修饰时的不同变构类型,进而产生不同的转录响应,符合OxyR的多级调控模型理论。通过生物信息学分析,显示OxyR在细菌中分布广泛,超过50%的完全基因组测序的细菌含有OxyR,同时发现它还分布在栖息于活性硫烷硫浓度较高环境的细菌以及一部分严格厌氧细菌中。对于这些细菌,OxyR更可能被用于调节活性硫烷硫压力。在地质进化尺度上,一部分含有OxyR细菌的进化年代或最早出现时间处于地球氧气含量很低而活性硫烷硫含量很高的时期,OxyR是一个古老的蛋白,彼时的作用可能主要是用来应对活性硫烷硫压力以及调控胞内硫烷硫水平。总而言之,我们在大肠杆菌中发现了转录调控因子OxyR感应活性硫烷硫并激活硫烷硫去除基因的表达。OxyR的过硫化修饰是迄今为止报道的OxyR的第五种具有转录活性的修饰形式。OxyR广泛存在于好氧细菌和厌氧细菌中,因此这种OxyR控制的负反馈调节可能代表了细菌应对外源和内源硫烷硫压力时广泛存在的保守机制。4.异养细菌中硫化氢氧化系统在硫化氢生物去除上的应用细菌中除了硫氧还蛋白和谷氧还蛋白可以将硫烷硫还原为硫化氢,硫醌氧化还原酶(SQR)和过硫化物双加氧酶(PDO)还可以将硫化氢和硫烷硫氧化成亚硫酸盐和硫代硫酸盐,因此这些细菌可能具有应用于硫化氢生物治理的潜力。多种工业活动和自然过程例如造纸业、污水处理以及沼气发酵等都会产生大量H2S,然而H2S是具有刺激性气味的有毒气体,需要被治理。生物过滤法是利用微生物酶催化作用去除硫化氢,由于相比于化学法和物理法具有效率高、成本低以及副产物低的特点,经常被用到的诸如废气和污水的硫化氢去除过程中。研究者已经尝试了各种反应池设计、各种微生物固定材料以及不同的营养供给以期实现稳定高效的去除效率,然而由于理论研究的局限,在起关键作用的微生物选择上,大部分的应用研究仍然局限于人们熟知的自养硫化氢氧化细菌,例如硫杆菌属、嗜酸硫杆菌属以及绿硫细菌属等。这些微生物在应用中存在的主要问题是它们的氧化产物硫酸会造成二次污染以及H2S去除效率的下降,如果要控制这一问题,则必须严格控制H2S和O2供给的比例,增加了成本。我们研究了多株含有sqr和pdo的异养细菌对于硫化氢的去除效率,与已经被广泛研究的几株自养细菌进行比较,发现一部分异养细菌与报道的自养细菌的氧化效率相当。我们发现异养硫化氢氧化细菌用于硫化氢生物去除的优势在于它们氧化硫化氢的时候不会产生硫酸盐,因此没有酸化的问题。基于以上研究,我们开发了一种结合Fe304纳米颗粒固定化细胞的方法,用于可循环的高效去除硫化氢。


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