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右美托咪定调控大鼠脑缺血再灌注PPAR-γ-TLR4-NF-κB信号转导

王守靓  
【摘要】:第一部分:大鼠脑缺血再灌注模型的建立及其形态学研究目的:本部分在有效制作大鼠大脑中动脉线栓阻塞脑缺血再灌注损伤模型的基础上,试图探讨其在临床上所造成脑组织细胞损伤的具体表现,从细胞形态学分析角度为后续的炎性及细胞凋亡效应提供临床依据。材料与方法:从本学院动物管理协会选取健康SD雄性大鼠40只,平均体重(280±18)g,随机将上述SD大鼠分成两组,分别记为假手术组(Sham组)与模型组(I/R组);具体措施为Sham组:不采取任何手术措施;I/R组:采用线栓法建立大鼠局灶性右侧脑缺血再灌注模型,缺血90分钟后拔出线栓,使得血流实现再灌注。过程中采用脑部血流仪检测大脑中动脉分布区的血流,当大鼠在插入栓线出现70%以上缺血并且维持90分钟后实现再灌注的,即为模型制作成功。具体考察指标为:HE、尼式细胞染色检测脑部组织细胞的炎性浸润情况;SEM扫描电镜检测脑部组织细胞表面破坏情况;TEM透射电镜检测脑部胞体内部细胞器等变化;线粒体膜电位分析线粒体跨膜电位的能量障碍,为下文做形态学依据。结果:模型成功性分析:Sham组大鼠整体发育良好,未出现大鼠死亡等情况;I/R组在缺血再灌注模型建立后大鼠实际存活率为85%,死亡3只,4只大鼠在解剖后脑血流图像并未出血,模型的成功率为65%。HE染色分析:Sham组在模型建立后细胞整体排列均一,数量较多,结构平整;I/R组大鼠细胞周围空隙增大,数量减少,空泡数目增多,形态规则性欠佳,组织液较多。尼式染色分析:Sham组细胞数量较多,整体均一,细胞形态正常,在整个组织分布中密度均匀;I/R组大鼠皮质组织和海马组织细胞密度稀疏,细胞出现固缩现象,体积逐渐缩小。SEM扫描分析:Sham组大鼠细胞生长模式正常,整体上排列密集,密度较大,形状规则,轮廓明显。在海马的SEM图片中,细胞之间连接性较好,微绒毛较多。I/R组大鼠细胞形态发生改变,连接性逐渐减弱,微绒毛数量逐渐减少,细胞凸起比较严重。TEM扫描分析:Sham组大鼠胞体内细胞内容物没有变化,质地均匀、生长状态良好。I/R组大鼠细胞内部出现一定程度的脂质沉淀出现,细胞呈现出明显的空泡显现。在海马组织细胞中,胞体内出现一定数量的溶酶体及吞噬体,海马组织细胞内部的线粒体及高尔基体出现肿大现象,病变程度严重。线粒体跨膜电位分析:Sham组大鼠皮质和海马组织的细胞线粒体膜电位均为红色荧光;I/R组大鼠皮质和海马组织细胞线粒体膜电位提示异常性,荧光为黄绿色,内部电位去极化现象的严重性。结论:大鼠脑缺血再灌注模型的建立对神经元细胞造成实质性伤害,细胞空隙增大、核质固缩、细胞器出现不同程度破坏;细胞数量整体上减少,存在一定程度的凋亡及坏死现象;线粒体跨膜电位异常提示细胞存在非程序性凋亡过程,为后续两部分的研究提供形态学依据。第二部分:DEX调控I/R大鼠脑免疫因子表达与细胞凋亡目的:在第一部分形态学研究的基础上,探讨大鼠脑部缺血再灌注损伤的炎性和细胞凋亡效应以及右美托咪啶对其炎性和细胞凋亡的抑制效应,以期为临床研究上提供启发和帮助,在治疗实践上提供具体策略。材料和方法:从本学院动物管理协会选取健康SD雄性大鼠40只,平均体重(276±16)g,随机将上述SD大鼠分成四组,分别记为Sham组、模型组(I/R组)、Dex1组和Dex2组;后三组大鼠均进行脑部缺血再灌注模型制作观察24小时,后期进行不同处理;具体措施为I/R组:不做药物干预,注射等量生理盐水;Dex1 组:以 DEX(10μg/kg)通过腹腔注射;Dex2 组:以 DEX(20μg/kg)通过腹腔注射;具体考察指标为炎性效应分析:免疫组化检测法分析炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、GFAP 具体表达;ELISA 法检测炎性因子 IL-6、IL-8、TNF-α、GFAP具体含量;流式细胞仪检测细胞凋亡表达、比率;DNA倍体分析检测细胞周期;Western-Blot法检测相关蛋白Atg5、Caspase-3、Bax、Bcl-2具体浓度表达;RT-PCR法分析细胞凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2的mRNA具体表达含量。结果:细胞炎性效应分析:(1)免疫因子分析:白细胞介素IL-6、IL-8、TNF-α及蛋白因子GFAP浓度比较:Sham组Dex2组Dex1组I/R组,P0.05,差异具有统计学意义。(2)免疫组化分析:四组大鼠浓度表达比较为:Sham组Dex2组Dex1组I/R组,大鼠缺血再灌注模型建立后机体炎性反应加重,相关免疫因子浓度增加,随着右美托咪啶注射含量的增加,整体状态好转。细胞凋亡效应分析:(1)凋亡率比较:四组大鼠的神经元细胞凋亡率比较为 Sham 组(4.87%)Dex2 组(6.45%)Dex1 组(12.33%)I/R 组(17.80%),各组数据之间两两比较,P0.05,差异具有统计学意义。(2)细胞周期分析:大鼠缺血性再灌注模型建立后大鼠脑部神经元细胞周期发生实质性改变,细胞周期的阻滞效应明显加强,细胞阻滞主要停留在G2期。右美托咪啶注射剂作用开始,神经元细胞周期的阻滞效应明显减弱,同步G2期的阻滞效应逐步减弱,比例下降为(26.55±3.89)%与(54.05±5.66)%。(3)Bax 和 Bcl-2 mRNA 的表达影响分析:Bax分析:Sham组Dex2组Dex1组I/R组,Bcl-2分析:I/R组Dex1 组Dex2 组Sham 组。(4)Westem-blot 分析:Caspase-3、Bax 及 Atg5等体现出了相同的浓度表达趋势,对比为Sham组Dex2 组Dex1组I/R组,且两组之间比较,P0.05,差异均具有统计学意义。抑细胞凋亡的蛋白酶分析对比关系为Shan组Dex2组Dex1组I/R组,两组比较之间,P0.05,差异具有统计学意义。结论:大鼠脑缺血再灌注模型对其细胞产生实质性伤害,神经元细胞炎性效应加强,同时细胞凋亡效应加强,细胞出现非程序性死亡过程。右美托咪啶注射剂减轻脑缺血再灌注损伤,具有抑炎性效应,对细胞凋亡起到一定的修复作用,细胞修复程度与其剂量成正相关,值得在临床上进一步研究推广。第三部分:DEX调控I/R大鼠脑PPAR-γ-TLR4-NF-κB信号转导目的:在构建大鼠脑缺血再灌注模型,模拟疾病的基础上,观察在其细胞凋亡及炎性反应过程中,信号通路PPAR-γ-TLR4-NF-κB调控脑缺血过程中的具体机制,为最终治疗缺血性再灌注损伤寻找潜在靶点做出一定的启发。材料与方法:本部分实验研究对象的选取及实验分组同第二部分。具体研究指标如下:免疫组化法检测信号通路因子TLR4、TRIF、PPAR-γ具体表达;RT-PCR检测信号通路因子TLR4、TRIF、PPAR-γmRNA具体表达;Western-Blot检测过程相关蛋白 TLR4、TRIF、NF-κB、PPAR-γ、p65、1κB、p-p65、p-1κB等浓度含量具体表达;统计分析数据,绘制TLR4/NF-KB在大鼠脑缺血模型中的具体反映调控机制。结果:免疫组化结果分析:信号因子TLR4的表达浓度上升,右美托咪啶注射后,其含量降低。PPAR-γ与TRIF的表达浓度与上述成负相关。RT-PCR结果分析:TRIF的含量上升,右美托咪啶使用后含量升高,与剂量成正相关。PPAR-γ的mRNA分析中右美托咪啶的使用促进其在脑部组织的表达含量,可以有效的抑制TLR4/NF-κB信号通路炎性因子的产生;TLR4在模型建立后含量上升,右美托咪啶使用后其含量降低,且与剂量成正相关。转录因子TLR4、TRIF、NF-κB分析:TRIF的分析中,四组比较为ShamI/RDex1Dex2,组间两两比较得出,P均小于0.05,差异具有统计学意义。免疫因子TLR4及NF-κB的蛋白含量表达体现出相同的趋势,四组比较为ShamDex2Dex1I/R组,组间两两比较,P均小于0.05,差异具有统计学意义。转录因子p65、1κB、p-p65、p-1κB分析:免疫抑制因子1kB及p65在模型建立后含量降低,组织细胞炎性反应及凋亡性加强。在右美托咪啶使用后,信号回路的免疫抑制因子含量出现不同程度上升,随着右美托咪啶注射剂量的上升其蛋白浓度表达上升,成正相关性。激活受体PPAR-γ分析:研究提示四组之间含量比较为I/R组Sham组Dex1组Dex2组,组间比较差异均小于0.05,差异具有统计学意义。结论:PPAR-γ-TLR4-NF-κB信号通路在大鼠脑缺血再灌注模型脑损伤中扮演了调控角色,其可以有效增加炎性效应及加速细胞的凋亡过程;右美托咪啶可以有效起到神经保护作用,对信号通路PPAR-γ-TLR4-NF-κB中的促炎性反应及促细胞凋亡过程起到了一定的抑制作用,具有较好的临床开发性。


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