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同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架修复软骨缺损的实验研究

吴帅  
【摘要】:[研究背景]软骨作为一种单一细胞成分的结缔组织,由单一的软骨细胞、纤维以及基质构成,在体内主要发挥着连接、支持、分散应力以及减少振荡等生理功能。然而,创伤、炎症以及退化等病理现象的发生容易引起软骨组织出现不同程度的损伤或者缺损,严重者还会导致关节炎的发生,因此对关节正常的功能造成了较大的影响,也给患者的正常生活带来了不便。由于软骨细胞自身的再生能力非常有限,因此当软骨缺损时就需要借助其他方式进行修复,关于软骨损伤的修复治理研究也是目前骨科和临床研究的重中之重。软骨缺损的修复过程极其复杂,而修复过程核相关调控机制尚未揭示。同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架在修复软骨缺损中有着良好的潜在应用前景。同种异体软骨细胞/成骨细胞的研究仍处于探索阶段,对于广泛应用于临床来讲仍有较大的距离,需要多种检测手段的全面配合。关于β-磷酸三钙生物陶瓷支架,材料的选择是治疗软骨缺损的重要内容。因此,在研究过程中,均需要权衡好治疗的风险及获益,才能为未来的临床应用提供更安全的保障。我们相信随着技术的进一步相互结合和深入及推广,将为同种异体软骨细胞成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架治疗软骨缺损提供切实的临床治疗指导。综合技术的使用能够为软骨缺损患者提供科学的理论指导去制定相应的治疗方案,使患者尽快康复,这为进一步研究软骨缺损奠定了坚实的理论基础。[研究目的]本研究首先探究同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架与软骨的组织相容性。其次,探索3D人工微/纳米支架在关节的组织修复中的应用价值。最后,探寻同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架对软骨细胞能量代谢和增殖的影响。[研究方法]第一部分:提取比格犬骨髓间充质干细胞,分别定向分化为软骨细胞和成骨细胞,将实验细胞分为三组:对照组、软骨细胞组、成骨细胞组。实验犬分为三组:β-TCP组(软骨缺损处放置空白β-TCP支架作为实验对照),软骨细胞β-TCP组(将培养的软骨细胞同β-TCP支架融合后放入软骨缺损模型犬中),软骨细胞/成骨细胞β-TCP组(将培养的软骨细胞同β-TCP支架融合及成骨细胞同β-TCP支架融合叠加模仿正常软骨及软骨下骨解剖结构后放入软骨缺损模型犬中);三组实验比格犬在相同条件下喂养,12周后处死做实验观察。通过MTT检测各组细胞中的增殖。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡、活力。使用 Alcian蓝结合测定法糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量。蛋白印迹分析细胞中ColII、BMP的蛋白表达。第二部分:提取比格犬骨髓间充质干细胞,通过微团干细胞培养和基于生物反应器的细胞负载支架培养分别制备软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP磷酸钙生物陶瓷支架和软骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架,分别植入比格犬股骨滑车软骨缺损模型,以治疗关节软骨缺损,观察同种异体软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP磷酸钙生物陶瓷支架修复软骨缺损情况,将软骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架设为阳性对照。第三部分:选择24只年龄为4-10个月、体重为7.5-10.0 kg的健康比格犬,以比格犬股骨滑车作为比格犬关节软骨缺损的研究模型。分别提取比格犬肋软骨的软骨细胞和骨膜的成骨细胞交叉使用以保证同种异体性。实验分为2组:对照组(软骨缺损模型,植入β-TCP生物陶瓷支架,n=12);复合体组(软骨缺损模型,植入同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-TCP生物陶瓷支架,n=12)。通过组织切片和显微镜观察支架上细胞增殖。通过ELIS A试剂盒定量检测软骨细胞中促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α水平。通过免疫组化分析不同处理组软骨细胞II型胶原蛋白和骨形态发生蛋白含量。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)、胰岛素样生长因子 2(Insulin-like growth factor 2,IGF-2)和GLUT蛋白表达。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞能量代谢途径中缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)、AMP 激活激酶(AMP-activated kinase,AMPK)和 ERK mRNA表达。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞糖酵解,氧化磷酸化,PPP以及糖原合成途径关键酶:3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)和糖原合酶激酶 3β(Glycogen synthase kinase 3,GSK3β)蛋白表达。通过酶联免疫检测不同处理组软骨细胞LC3和Beclin-1水平。[研究结果]第一部分:培养4小时后,软骨细胞组较对照组细胞增殖升高(P0.05),成骨细胞较对照组细胞增殖升高(P0.05)。培养第24小时后软骨细胞组较对照组细胞增殖升高(P0.05),成骨细胞较对照组细胞增殖升高(P0.05)。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组细胞凋亡降低(P0.05),成骨细胞较软骨细胞凋亡率降低(P0.05)。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组细胞活力升高(P0.05),成骨细胞较软骨细胞活力升高(P0.05)。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组GAG的含量升高(P0.05),软骨细胞组较成骨细胞组GAG的含量比较无差异(P0.05)。软骨细胞组较对照组ColⅡ的蛋白表达升高(P0.05),成骨细胞组较软骨细胞组ColⅡ的蛋白降低(P0.05),成骨细胞组较软骨细胞组和对照组BMP蛋白表达升高(P0.05),对照组较软骨细胞组BMP蛋白表达无差异(P0.05)。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组细胞形态评分升高(P0.05),软骨细胞β-TCP组较β-TCP组细胞形态评分升高(P0.05)。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组表面形态评分升高(P0.05)。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组中IL-1β的mRNA表达降低(P0.05)。β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和软骨/成骨β-TCP组TNF-α mRNA表达升高(P0.05)。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组IL-6 mRNA 表达降低(P0.05)。第二部分:使用微团干细胞培养培养可以成功地从骨髓间充质干细胞诱导获得同种异体软骨细胞和成骨细胞。通过应用生物反应器的细胞负载支架培养物成功地制备软骨细胞/成骨细胞的β-TCP生物陶瓷支架组、软骨细胞的β-TCP生物陶瓷的支架组、β-TCP生物陶瓷的支架。将支架用于比格犬关节软骨缺损的治疗。比格犬股骨滑车的相对软骨再生能力如下:软骨细胞/成骨细胞的β-TCP生物陶瓷支架组软骨细胞的β-TCP生物陶瓷的支架组β-TCP生物陶瓷的支架。第三部分:对照组和复合体组细胞增殖率均随时间增加而升高,与对照组相比,复合体组1周、3周、5周和8周细胞增殖率升高(P0.05)。与对照组相比,复合体组IL-1、IL-6、TNF-α水平降低(P0.05)。与对照组相比,复合体组II型胶原蛋白和骨形态发生蛋白含量升高(P0.05)。与对照组相比,复合体组TGF-β、IGF-2和GLUT蛋白表达量增加(P0.05)。与对照组相比,复合体组HIF-1 α、AMPK和ERK蛋白表达量增加(P0.05)。与对照组相比,复合体组GAPDH、NADPH和GSK3β蛋白表达量降低(P0.05)。与对照组相比,复合体组LC3和Beclin-1水平降低(P0.05),说明复合体抑制自噬。[研究结论]1.探索了 BMSCs来源的同种异体软骨细胞和成骨细胞具有良好的细胞活性。同种异体软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架可以与周围软骨产生良好的生物相容性。2.微团干细胞培养培养和基于生物反应器的细胞加载支架培养可以制备软骨细胞/成骨细胞加载的β-TCP生物陶瓷支架,用于关节软骨缺损的治疗且效果良好。这表明同种异体软骨细胞/成骨细胞负载β-TCP生物陶瓷支架可潜在地用于治疗软骨缺损患者。3.同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-TCP生物陶瓷支架增加软骨细胞能量代谢和增殖,减少细胞自噬。


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