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基于绿色荧光蛋白的多硫化物敏感型探针的构建及其在海洋细菌硫代谢研究中的应用

胡欣  
【摘要】:自然界中的硫循环与碳循环、氮循环紧密相关,它们通过各种生物地球化学过程耦合链接。海洋微生物由于其丰度高、分布广、代谢途径多样、适应性强,因此在硫循环和碳、氮循环的耦合及相关生物地球化学循环中发挥至关重要的作用。当前,许多沿海地区饱受低氧/缺氧等生态灾害的困扰,其特征之一是有毒硫化氢的产生和积累。近年来,一系列研究表明:异养细菌的异化型硫氧化过程,对保护海洋生态系统免受硫化氢的毒害具有积极作用。多硫化物是硫氧化代谢过程中的重要中间产物,是硫循环的重要组成部分,已在微生物席、热液喷口、沉积物和水柱等生态系统中被发现,广泛存在于多种海洋生境中,在许多生物地球化学过程中发挥着多种重要作用。多硫化物包括H2Sn(n≥2)、RSnH(n≥2)和RSnR(n≥ 3),普遍存在于原核和真核细胞内,是硫化物氧化的中间产物。这类化合物一般具有链状结构,含有一种被称为“零价硫”或“硫烷硫”或“硫代亚砜硫”的硫原子,易于异构形成硫代亚砜结构,产生一个活性“单态硫”,具有亲电性和亲核性。硫代亚砜键的不稳定性可使硫烷硫原子可逆性地结合蛋白巯基或二硫键。在生理条件下,过硫化物的酸性比硫醇强,硫醇主要以质子化的形式存在,而过硫化物则以去质子化阴离子的形式存在。过硫自由基上的奇数电子和邻近硫原子易于形成稳定的共振结构,使得过硫化物中的氢原子较容易电离。多硫化物的结构特点,使其在自然界的硫循环中发挥着重要作用,可以选择性地氧化、还原或歧化,参与了包括黄铁矿的形成、有机物的硫化、还原性硫物质间的同位素交换和金属螯合等多种环境相关的过程。多硫化物在生理活动中也起着重要的作用,包括诱导Ca2+代谢流、调控肿瘤抑制因子磷酸化酶、维持胞内的氧化还原状态等,也是线粒体产能代谢的有效调节因子。细胞内超过40%的蛋白通过自身的巯基化修饰参与胞内的代谢过程,而高水平的多硫化物既可以维持蛋白的过硫化修饰,又可以增强细胞的抗氧化作用。此外,活性硫物质(RSS)包括多硫化物、过硫化物等含硫有机小分子,与活性氧物质(ROS)的化学结构和代谢过程相似,RSS比ROS具有更多化学和生物化学多样性,许多ROS的检测方法对RSS更为敏感,这暗示着RSS在细胞内的信号转导中有广泛的作用,RSS作为氧化还原敏感型蛋白的调节因子可能比ROS更有效。RSS的这些特征,以及它们在进化中的重要作用,使它们成为近年来的研究热点。深入研究多硫化物在微生物中的代谢机制,无论对海洋生态系统的保护还是对生理过程的分析都是极其重要的。目前对于多硫化物的研究进展相对缓慢,原因之一是没有合适的可以在细胞内定位并进行实时定量检测多硫化物水平的方法。因此构建高效、高选择性、高灵敏性和响应快速的定量检测多硫化物的方法是目前亟待解决的问题。基于绿色荧光蛋白(GFP)的基因编码氧化还原探针不需破坏细胞结构,具有灵敏度高、选择性好、信噪比低等优点而被广泛应用。本论文基于绿色荧光蛋白(GFP),构建了一种实时、动态、可定位于亚细胞结构的多硫化物敏感型探针psGFPs。应用该探针,研究了大肠杆菌Escherichia coli和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742亚细胞区域多硫化物的分布。为了进一步提高多硫化物探针的灵敏度,选择合适的硫转移酶,构建了融合蛋白探针,分析研究了影响融合蛋白探针功能的若干因素。以海洋玫瑰杆菌Ruegeria pomeroyi DSS-3为模式菌,深入分析了有机硫和无机硫的转化机制。1.通过定点突变改变氧化还原敏感型绿色荧光蛋白roGFP表面两个半胱氨酸之间的距离,使其在氧化状态下形成多硫键而不是二硫键,首次构建了多硫化物敏感型绿色荧光蛋白探针psGFP1.1,该探针为比率型探针,标准中点电位为-318mV,具有氧化还原反应可逆性,在生理条件下,408/488比值受pH的影响较小,不受ROS干扰,能够特异性的感应多硫化物,可实现细胞器水平的定位,实时、动态检测胞内多硫化物水平的变化。与之前报道的探针相比,具有明显的优势。以E.coli为模式生物,应用psGFP1.1探针分析了E.coli生长周期中胞内多硫化物水平的动态变化。结果表明,在对数早期,内源性多硫化物含量较低,之后逐渐升高,在对数末期含量最高,在稳定期开始降低、逐渐趋于平衡。这一结果与SSP4探针一致。胞内的多硫化物水平与细菌的生长阶段有关,探针的氧化态比例从20%升高至60%,表明多硫化物可能参与了生长阶段相关的基因表达和酶活性的调控。以S.cerevisiae BY4742为模式生物,应用psGFP1.1探针分析了细胞质、线粒体和过氧化物酶体中的多硫化物水平。与E.coli不同,在延滞期和对数早期,多硫化物含量较高,之后逐渐降低,在对数末期降为最低,而稳定期有所升高。在延滞期和对数早期,过氧化物酶体中多硫化物含量低于细胞质和线粒体,而在稳定期则情况相反。这说明多硫化物在亚细胞结构中分布不均匀,胞内多硫化物可能具有多种来源和功能。CBS和CSE是两种主要利用胱氨酸产生多硫化物的酶,而3MST和CARS主要利用半胱氨酸产生多硫化物。用胱氨酸处理S.cerevisiae细胞悬液,细胞质、线粒体和过氧化物酶体中多硫化物水平显著升高,过氧化物酶体中升高最多。而用半胱氨酸处理S.cerevisiae细胞悬液,多硫化物在过氧化物酶体中没有变化,在细胞质和线粒体中明显增加。2.为进一步提高psGFP探针的检测效率,将psGFP蛋白与具有硫转移酶活性的DUF442和Rd12蛋白通过一段链接肽连接起来,首次构建了DUF442-psGFP和Rd12-psGFP融合蛋白探针。通过体外实验检测了探针感应不同硫烷硫的能力,对比分析了融合蛋白探针和未融合的psGFP探针活性的差异,Rd12-psGFP探针有明显的改进,检测效率相对提高。讨论了影响融合蛋白活性的因素,为探针的进一步改造和优化提供了依据。融合蛋白DUF442-psGFP、Rd12-psGFP和未融合的psGFP蛋白经DTT、HSSH、S8、Me-SSS-Me和硫代硫酸钠处理后,三种蛋白的反应趋势基本一致,均能被HSSH和S8氧化,均能轻微地感应Me-SSS-Me,均不能和硫代硫酸钠反应。DUF442和Rd12蛋白的融合对psGFP蛋白的活性影响较小。与psGFP蛋白相比,Rd12-psGFP融合蛋白感应HSSH和S8的能力小幅度提高;DUF442-psGFP融合蛋白感应Me-SSS-Me的能力有一定增强。DUF442和Rd12蛋白具有硫转移酶的活性,能够将硫烷硫从合适的硫供体上转移至新的硫受体上。但实验中DUF442-psGFP和Rd12-psGFP融合蛋白均不能感应硫代硫酸钠,感应HSSH的能力与未融合的psGFP蛋白相比没有明显提高,说明融合后的Rd12或DUF442未能将硫烷硫从硫代硫酸钠或HSSH转移给psGFP,没有明显的催化活性。详细分析了影响融合蛋白活性的因素,包括融合蛋白的结构域顺序、氧化还原酶的活性、链接肽的设计以及氧化还原酶和荧光蛋白之间的位置关系等。3.首次检测了玫瑰杆菌R.pomeroyi DSS-3胞内的多硫化物水平,证实了 R.pomeroyi DSS-3转化有机或无机硫源的过程中产生了多硫化物,并可将多硫化物氧化生成硫代硫酸盐。这表明在有机硫化物和还原态无机硫化物之间的转化过程中,多硫化物可能是重要的中间产物,玫瑰杆菌发挥了主要的物质转化作用。研究了R.pomeroyi DSS-3生长周期中胞内多硫化物水平和氧化还原状态的变化。psGFP1.1和roGFP2探针成功地在R.pomeroyi DSS-3胞内表达。胞内多硫化物水平和氧化还原状态与海洋玫瑰杆菌的生长阶段有关,多硫化物参与了与生长阶段相关的基因表达和酶活性的调控,并且伴随胞内氧化还原状态的变化。在硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统的作用下,胞内多硫化物水平在稳定期下降并逐渐趋于稳定,达到动态平衡。研究了R.pomeroyi DSS-3转化有机或无机硫源的能力。R.pomeroyi DSS-3转化半胱氨酸、甲硫氨酸、丙酮硫(S8)和DMSP的过程中,胞内均有多硫化物产生,且多呈现先升高后降低的趋势,转化丙酮硫(S8)产生的多硫化物水平最高。R.pomeroyi DSS-3具有将有机或无机硫源转化为多硫化物的能力,而且在转化有机或无机硫源生成多硫化物的过程中伴随着胞内氧化还原状态的变化。研究了R.pomeroyi DSS-3转化有机或无机硫源过程中的代谢产物,分析了代谢机制。R.pomeroyi DSS-3转化半胱氨酸、硫氢化钠和丙酮硫(S8)可产生硫代硫酸盐,且转化半胱氨酸产生的硫代硫酸盐最多,转化甲硫氨酸和DMSP不产生硫代硫酸盐。在实验中发现R.pomeroyi DSS-3内并不积累亚硫酸盐,这可能是由于细菌内多硫化物氧化速率较慢,氧化生成的亚硫酸盐与积累的多硫化物迅速反应生成硫代硫酸盐。综上所述,本论文构建了基于绿色荧光蛋白的多硫化物敏感型比率探针,可以实时、动态检测亚细胞区域的多硫化物水平,为检测胞内多硫化物水平提供了有效工具。应用该探针,研究了E.coli和S.cerevisiae BY4742亚细胞区域多硫化物的分布。为提高探针的灵敏度,选择合适的硫转移酶,构建了融合蛋白探针,分析了影响融合蛋白探针功能的若干因素。以海洋玫瑰杆菌R.pomeroyi DSS-3为模式菌,检测了 R.pomeroyi DSS-3胞内的多硫化物水平,证实了 R.pomeroyi DSS-3转化有机或无机硫源的过程中产生了多硫化物,深入分析了有机硫和无机硫的转化机制。海洋细菌硫代谢途径的研究,可深入理解海洋细菌在硫循环中的生态作用,有助于解析环境条件变化对海洋硫循环的影响,为研究海洋硫循环和碳循环的耦合提供理论依据。


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