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玉米PPR基因PPR101、PPR231参与种子发育的功能研究

杨欢欢  
【摘要】:目前玉米已经成为世界第一大粮食作物。为应对全球人口增多和经济发展需要,保证玉米产量和提高品质尤为关键。此外作为典型的单子叶植物,玉米因具有较大籽粒和丰富的突变体库等优势,成为研究种子发育的重要模式植物。因此探究玉米种子发育的分子机制、解析相关基因的功能,进而揭示种子发育遗传调控机制、构建种子发育调控网络,为提高玉米的产量和品质奠定了重要理论基础并且具备一定应用指导价值。线粒体是细胞进行氧化磷酸化合成ATP供能的主要场所,是细胞中代谢高度活跃的细胞器。作为细胞代谢和能量稳态的核心,线粒体在种子发育过程中发挥重要作用。绿色开花植物的线粒体基因组中的内含子一般是Ⅱ类内含子,在被翻译成为有生物功能的蛋白质之前需要被精确剪接。线粒体内含子的正确剪接对于植物的生长发育非常重要。但是目前有关内含子剪接的分子机制仍不明确。PPR蛋白作为一类核基因编码的RNA结合蛋白,广泛参与调控线粒体RNA内含子的剪接、RNA编辑、RNA成熟与稳定和翻译等转录后加工过程。玉米基因组中PPR基因的数量超过450个,作为一类庞大的蛋白家族,仍有大量的PPR基因的分子功能尚未被研究。因此充分发掘和鉴定调控玉米种子发育的PPR基因,开展PPR基因的克隆及线粒体基因功能的研究,对实现玉米籽粒的定向改良具有重要作用。本研究从美国UniformMu玉米突变体库中获得了两个种子发育缺陷突变体:ppr101和ppr231。通过表型观察、连锁鉴定、等位突变体杂交等实验,确定了PPR101和PPR231基因中Mu转座子插入造成的单基因隐性突变是导致种子发育缺陷的原因。通过蛋白亚细胞定位、线粒体蛋白质编码基因表达水平检测、内含子剪接效率分析以及线粒体复合物Ⅰ的组装和活性检测,探究了PPR101和PPR231在玉米种子发育过程中的分子功能。结果表明,PPR101和PPR231对于线粒体Ⅱ类内含子的剪接、线粒体复合物Ⅰ的组装和活性、线粒体呼吸链的功能以及玉米种子发育具有重要作用。本研究也揭示了线粒体单一内含子的剪接需要多个PPR蛋白等剪接因子的参与,这对阐明内含子的剪接机制具有一定理论意义。主要结论如下:1)PPR101和PPR231基因突变造成种子发育缺陷ppr101/+和ppr231/+杂合体自交后代果穗均分离出约1/4比例的突变体籽粒,表明这两个突变都是核编码的单基因隐性突变。其中ppr101突变体呈空果皮(emp)表型,ppr231突变体呈小籽粒(smk)表型。pp101突变体籽粒在整个种子发育过程中,体积均明显小于野生型,且果皮呈现白色、皱缩、塌陷的状态。胚和胚乳发育严重缺陷,胚胎发育停滞在转变期,胚乳发育滞后,淀粉积累减少。随着果皮的生长,在果皮与胚乳之间出现了一个空腔。ppr231突变体籽粒小,胚和胚乳发育不完全,胚没有明显的组织分化,且胚乳的发育也较野生型相对迟缓。ppr101和ppr231突变体籽粒呈现胚胎致死,均不能正常萌发。表明PPR101和PPR231对玉米胚胎发生和胚乳发育有重要作用。2)PPR101和PPR231均是定位于线粒体的P类PPR蛋白PPR101和PPR231是典型的P类PPR蛋白。其中PPR101由647个氨基酸组成,含有16个P基序;PPR231由526个氨基酸组成,含有10个P基序。在两个蛋白的N端均含有信号肽且C端无其他结构域。构建PPR101和PPR231与GFP标签的融合蛋白,在烟草叶片下表皮细胞瞬时表达后观察荧光信号,发现两个PPR蛋白均定位于线粒体。3)PPR101和PPR231参与线粒体内含子的剪接通过RT-PCR比较野生型和两个突变体中线粒体蛋白编码基因的表达情况。结果显示,与野生型相比,在ppr101-1突变体中,线粒体nad5转录本的表达水平严重降低,几乎检测不到。在ppr231-1突变体中,nad2和nad5转录本的表达水平均明显低于野生型。用RT-PCR和qRT-PCR对nad2和nad5基因中内含子的剪接缺陷情况进行分析发现,ppr101突变体中nad5内含子1的剪接效率降低,内含子2的剪接几乎完全缺失;ppr231突变体中nad2内含子3以及nad5内含子1、2、3的剪接效率均降低。4)PPR101和PPR231功能缺失影响线粒体复合物Ⅰ的组装和活性线粒体复合物Ⅰ由嵌入线粒体内膜的膜臂以及突出在基质的外周臂组成。Nad2和Nad5是线粒体复合物Ⅰ膜臂的两个重要组成亚基。通过BN-PAGE、考马斯亮蓝染色和NADH脱氢酶活性实验对线粒体复合物的组装以及复合物Ⅰ的活性进行检测。结果显示ppr101-1和ppr231-1突变体中的复合物Ⅰ丰度均明显降低,而复合物Ⅲ和Ⅴ的丰度显著升高,说明线粒体复合物Ⅰ的组装受阻。同时ppr101-1突变体复合物Ⅰ的活性几乎丧失,ppr231-1突变体复合物Ⅰ活性明显降低。因此PPR101和PPR231蛋白功能的缺失,造成线粒体nad5和nad2内含子剪接的缺陷,进而影响线粒体复合物Ⅰ的组装和活性。5)PPR101和PPR231基因突变导致交替呼吸途径激活线粒体复合物Ⅰ的功能缺陷会导致线粒体氧化磷酸化途径受阻,从而激活交替氧化酶途径。玉米基因组中含有三个编码交替氧化酶的基因AOX1、AOX2和AOX3。我们分别从RNA和蛋白水平上对AOX基因的表达情况进行分析。RT-PCR和qRT-PCR实验结果显示,与野生型相比,ppr101和ppr231突变体中AOX2基因的表达量明显上调。与以上结果一致的是,Western b1ot实验中用特异抗体检测AOX蛋白丰度发现,ppr101-1和ppr231-1突变体中AOX蛋白丰度显著升高,而在野生型中几乎检测不到。说明PPR101和PPR231基因的突变,抑制复合物Ⅰ的组装和活性以及线粒体呼吸链的正常功能,导致线粒体氧化磷酸化途径受阻,交替氧化酶途径被诱导激活。6)PPR101与PPR231无直接的相互作用PPR101和PPR231均负责多个线粒体Ⅱ类内含子的剪接,与此同时,它们的功能又有一些交叉,即PPR101和PPR231均参与了nad5内含子1和2的剪接。有研究表明PPR蛋白具有形成蛋白复合体的能力,所以它们可能通过形成特定的剪接复合体参与线粒体某一个内含子的剪接。我们利用酵母双杂交技术探究了 PPR101和PPR231蛋白是否通过相互作用共同参与内含子的剪接。结果未发现PPR101和PPR231之间存在相互作用。因此,二者虽然均参与了nad5内含子1和2的剪接,但可能并不是通过直接的物理互作而发挥功能。综合以上研究结果表明,PPR101参与nad5内含子1和2的剪接,PPR231参与nad2内含子3以及nad5内含子1、2、3的剪接。PPR101和PPR231基因突变,导致nad2和nad5内含子剪接的缺陷,造成Nad2和Nad5亚基蛋白的异常,影响线粒体复合物I的组装和活性,导致线粒体呼吸链的氧化磷酸化受阻。进而引起一系列反馈调节,包括线粒体呼吸链其他复合物的积累、ZmAOX2基因表达量的上调以及交替氧化酶途径的激活,最终抑制玉米种子胚胎发生和胚乳发育,造成种子败育。因此表明PPR101和PPR231对于线粒体RNA转录后加工、线粒体功能以及玉米种子发育具有重要作用。


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