腺苷激酶及4-羟基壬烯醛在心脏缺血再灌注损伤中作用及机制研究

【摘要】：研究背景急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)可能导致恶性心律失常、心源性休克、猝死等严重不良心血管事件,是威胁人类健康的主要原因之一。再灌注治疗,如溶栓和经皮冠状动脉介入治疗,能够开通堵塞的冠状动脉,恢复心脏组织血运,挽救缺血心脏组织,减少心肌梗死面积,改善患者预后。因此,再灌注治疗成为治疗AMI最有效的手段。然而,再灌注治疗本身也可对心脏组织产生损伤,即定义为心脏缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。MIRI主要表现为包括室性期前收缩、室性心动过速等在内的心律失常、心功能持续障碍、微血管阻塞和程序性心肌细胞死亡。在MIRI中程序性心肌细胞的死亡方式包括细胞凋亡、程序性坏死、焦亡、铁坏死等多种,其中以细胞凋亡和程序性坏死最为重要。已经证明再灌注引起的程序性心肌细胞的死亡可能会导致心肌梗死的面积最终增加近一倍。因此,减少再灌注引起的心肌细胞的死亡是减少缺血再灌注损伤的关键。但现仍未找到有效的减少心肌细胞死亡的方式。由此深入探讨心肌缺血再灌注损伤中细胞死亡发生与调节的机制,寻找有效的减轻缺血再灌注损伤的靶点和方法,是目前心肌保护领域的研究热点。腺苷激酶(Adenosinekinase,ADK)是人体内代谢腺苷的关键酶类之一。腺苷能够在缺血、低氧、创伤等条件下发挥细胞保护作用,有效防止缺血再灌注引起的心肌损伤。由于腺苷在体内半衰期很短等原因,因此腺苷至今仍未能有效地在临床用于预防心肌缺血再灌注损伤的治疗。ADK是哺乳动物细胞中表达量最多的核苷激酶之一,广泛表达在心脏、肝、脑等器官组织中。ADK可以将心肌细胞中大约90%的腺苷经转化为单磷酸腺苷(Adenosinemonophosphate,AMP),因此,ADK活性的高低决定了心肌中腺苷的浓度。除此之外,ADK还有调节炎性物质表达,以及潜在的磷酸化激酶的作用。已经有研究证明ADK在癫痫发作、脑缺血过程中发挥了重要的作用。腺苷激酶在MIRI中是如何变化的,以及发挥了怎样的作用,如何发挥作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.抑制ADK对于MIRI的保护作用。2.抑制ADK是否可以减少MIRI中的细胞死亡。3.抑制ADK如何影响MIRI中的细胞死亡。研究方法我们在小鼠心脏缺血再灌注模型中抑制ADK活性或减少ADK表达后,以探究ADK对MIRI后心脏损伤以及心功能的影响,之后又探究了抑制ADK后对MIRI中细胞程序性死亡的作用。使用H9c2(大鼠心肌细胞系)以及乳大鼠原代心肌细胞构建缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,围绕抑制ADK活性如何调节MIRI中细胞程序性死亡展开研究。(一)动物实验1.动物实验方案:方案一抑制ADK酶活性:将小鼠随机分为4组,分别为假手术组(sham组),药物注射组(ABT702组),缺血再灌注组(IR组)和缺血再灌注加药物注射组(ABT702+IR)。对于ABT702组和ABT702+IR组,在手术操作前半小时,给予ADK激酶抑制剂ABT702(2 mg/Kg)腹腔内注射。对于sham组和IR组在术前半小时给予同等剂量的DMSO。方案二减少ADK在体表达:将小鼠随机分为3组,分别为假手术组(sham组),病毒对照组(AAV9-GFP+IR),病毒组(AAV9-shADK+IR)。对于病毒组在术前3周,给小鼠经尾静脉注射带有心脏特异性启动子的AAV9-shADK,病毒对照组注射AAV9-GFP。在实验方案中,依据不同研究目调整最后取材时间。于MIRI后2 h取血测量LDH指标。于MIRI后24h取材测量心功能。其他指标于MIRI后4h取材进行检测。2.小鼠MIRI模型建立:选取6-8周龄左右成年C57BL/6雄性小鼠,开胸暴露心脏后用结扎线结扎左前降支30 min后,打开活结。对于假手术组,仅将线穿过动脉,但并不结扎,其余操作相同。分别于再灌注2h、4h、24h后,用0.8%戊巴比妥钠再次麻醉小鼠并取材。3.心功能的检测:使用小动物心脏彩超评价心功能。在小鼠MIRI后24 h进行测定,在小动物心脏超声M超模式下进行测定,通过检测数据计算心脏左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)和短轴缩短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)进行判断。4.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝(Evansblue,EBD)和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。5.血浆乳酸盐脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)和腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。6.电镜检测:小鼠MIRI后于缺血再灌注区域取1立方微米心肌组织后用戊二醛溶液进行固定后,在山东大学电子显微镜中心使用透射电镜进行检测。7.心肌细胞凋亡检测:在动物实验中,将心肌组织取材后首先将组织浸泡于4%多聚甲醛进行固定,之后用石蜡包埋、切片。采用TUNEL免疫组化染色的方法检测凋亡心肌细胞数量。8.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白(Caveolin 3,CaV3)联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。9.蛋白检测:用心肌组织提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳进行分离、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.mRNA检测:提取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。11.统计分析:计量资料数据以均数±标准误(Means±SEM)表示,应用GraphPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P0.05为差异具有统计学意义。(二)细胞实验1.细胞实验方案:为了研究ADK对于MIRI中细胞死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞和大鼠原代心肌细胞建立缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,通过TUNEL染色和细胞流式术检测凋亡和坏死的细胞,此外检测了凋亡通路和坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定ADK是否通过连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)来调节 MIRI 中的细胞死亡,我们使用XIAP蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞凋亡和程序性坏死比例以及凋亡和程序性坏死通路重要蛋白的调节情况。为了确定是通过腺苷通路上哪个受体发挥作用,首先通过PCR检测了 MIRI后受体的变化情况,之后用A2B受体的抑制剂,继而检测发生程序性坏死和凋亡的细胞数量。最后为了检测,ADK对MIRI中线粒体的影响,检测了线粒体膜电位,线粒体ROS产生以及线粒体通道转化孔的开放情况。2.细胞H/R处理:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱(气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气)。将细胞放入缺氧培养箱培养12h后,放入正常培养箱后再培养1-4h,收取细胞。3.通过小干扰减少小鼠体内XIAP蛋白:通过对细胞转染XIAP小干扰,减少XIAP蛋白含量。4.线粒体活性氧的检测:使用MitoSOXRed检测线粒体ROS水平。5.线粒体膜电位检测:使用JC-1染色检测线粒体膜电位水平。6.细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。7.细胞凋亡检测:在细胞实验中,细胞爬片后,经过H/R刺激,用TUNEL免疫荧光方法进行H9c2心肌细胞的凋亡检测。8.ATP含量检测:细胞经相应处理后充分裂解并收集,使用ATP检测试剂盒对ATP进行检测,反应完成后使用多功能酶标仪对吸光度进行检测,并通过标准曲线标化后计算结果。9.线粒体通道转化孔检测:通过Calcein-AM和Cocl2共同染色检测线粒体通道转化孔开放的情况。10.蛋白、RNA检测:同动物实验步骤。11.统计分析:同动物实验步骤。研究结果1.在MIRI中抑制ADK活性可以减少心梗面积,改善心功能ADK在再灌注2-4 h一过性升高,在再灌注后6 h恢复正常。使用ADK激酶抑制剂ABT-702或干扰ADK体内表达可以明显减少MIRI后心肌梗死面积。ADK抑制剂同样可以减少血浆中LDH水平和改善心脏LVEF,LVFS指标。同样,电镜观察发现ADK抑制剂可以改善MIRI后肌节和线粒体损伤。此外我们也观察到,ADK抑制剂会减慢小鼠的心率,但对血压没有影响。2.抑制ADK活性可以减少小鼠MIRI中细胞凋亡和程序性坏死TUNEL染色发现,抑制ADK活性可以减少心脏组织缺血危险区凋亡细胞数量。此外抑制ADK活性可以减少caspase-8,caspase-9,caspase-3的增加,但对caspas-12没有影响。再者抑制ADK活性对Bax和Bcl-2的蛋白量没有调节作用,但是可以提高p-P38蛋白含量。EBD-CaV3染色发现ADK抑制剂使坏死细胞减少。且 ADK 抑制剂可以减少 RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII蛋白量,但是对RIP1,p-RIP1,CaMKⅡ蛋白量没有影响。3.抑制ADK活性可以减少H9c2 H/R模型中细胞凋亡和程序性坏死在细胞实验中我们同样可以观察到,抑制ADK活性可以减少凋亡细胞。且可以减少活化的caspase-9,caspase-8和caspase-3蛋白量。同样ADK抑制剂可以减少P38 MAPK的磷酸化,但对Bax,Bcl-2和MAPK的含量没有明显作用。细胞流式发现,ADK抑制剂减少了 H/R诱导的细胞程序性坏死,同时减少了程序性坏死通路的RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII蛋白量。4.抑制ADK活性对细胞凋亡和程序性坏死的调控是通过XIAP介导为了探讨ADK是如何调控细胞凋亡和坏死,实验结果发现,抑制ADK活性可以增加XIAP,p-XIAP的蛋白含量。此外ADK活性抑制可以增加p-AKT的蛋白含量。而使用AKT抑制剂MK-2206可以减少ADK抑制剂对XIAP,p-XIAP的作用。而使用siRNA干扰XIAP的表达后,也可以削弱ADK抑制剂对凋亡以及程序性坏死的调控。5.抑制ADK活性对于H/R诱导的细胞死亡的调节作用是由腺苷受体来介导使用腺苷受体抑制剂后可发现抑制ADK活性后对XIAP以及p-XIAP的调节作用消失。RT-qPCR检测小鼠组织和心肌细胞发现A2B的mRNA变化最为明显,其次为A1受体。使用A2B受体拮抗剂后发现抑制ADK活性后对XIAP和p-Akt、p-XIAP的调节作用以及对细胞凋亡和坏死的调节作用下降。6.抑制ADK活性可以改善H/R后线粒体功能,并且可以减少ROS的产生使用ADK活性抑制剂后可发现细胞H/R后线粒体膜电位的去极化减弱。Calcein-AM染色发现mPTP孔道的开放减少,此外线粒体ROS的生成减少,ATP的生成也可以被改善。电镜观察也可以发现抑制ADK活性可以改善心肌细胞处线粒体损伤和肿胀。研究结论1.抑制ADK激酶活性可以在MIRI中发挥保护心脏作用。2.抑制ADK减少MIRI中心肌细胞的凋亡和程序性坏死。3.抑制ADK可以通过腺苷受体A2B/Akt/XIAP发挥作用。4.ADK可以成为治疗MIRI的潜在靶点。研究背景由前述可知,再灌注治疗是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)最有效的治疗手段。然而再灌注本身也可导致心肌的损伤称为心脏缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。针对 MIRI 进行治疗,对于改善AMI患者愈后,减少患者心衰的发生具有重要的意义。而心肌细胞程序性死亡是MIRI中重要的环节,针对MIRI中的心肌细胞程序性死亡对于减轻MIRI损伤具有重要意义,而程序性坏死又是心肌细胞程序性死亡的重要的方式之一。4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)是细胞内毒性最强的醛类物质之一。4-HNE是脂质过氧化的重要产物。具有超强的生物反应活性,生成后可以迅速和细胞内磷脂,核酸,蛋白发生加成反应,影响其生物功能。在生理状态下4-HNE的浓度为0.3-5 μM,并在多种生理功能中起到信号调节因子的作用。在氧化应激的情况下,4-HNE可以增加10-100倍,并通过抑制基因表达和修饰蛋白从而发挥细胞毒性作用。在MIRI损伤中,4-HNE可以增加为原来的6倍。已知.4-HNE对于MIRI中细胞凋亡、自噬都有着调节作用,但其对MIRI中细胞程序性坏死的调节作用以及如何发挥这种调节作用还未可知。研究目的本课题的主要目的在于探讨:1.在MIRI中程序性坏死和4-HNE的变化。2.4-HNE是否调节MIRI中程序性坏死。3.4-HNE通过何种机制调节MIRI中程序性坏死。研究方法我们采用小鼠心脏缺血再灌注模型以及离体心脏灌流模型研究了减少或增加4-HNE后对MIRI中细胞程序性坏死的影响;使用大鼠心肌细胞系H9c2,围绕提高4-HNE如何调节MIRI中细胞程序性坏死展开研究。(一)动物实验1.动物实验方案:在体小鼠心脏缺血再灌注模型:将6-8周C57BL/6小鼠(Wide type,WT)和乙醛脱氢酶过表达小鼠(ALDH2-transgenic,ALDH2-Tg)随机分为3组,分别为假手术组(sham组),缺血再灌注组(I/R组)和乙醛脱氢酶过表达+缺血再灌组(ALDH2-Tg+I/R)。离体小鼠灌流模型:将6-8周C57BL/6小鼠随机分为2组,分别为假手术组(sham 组),4-HNE 灌流组。2.小鼠心脏缺血再灌注模型的建立:同前构建小鼠缺血再灌注模型和假手术模型。在结扎后30 min,恢复冠脉血流,之后4 h用0.8%戊巴比妥钠麻醉小鼠并取材。3.离体小鼠心脏灌流模型:取6-8周成年雄性C57BL/6小鼠,注射戊巴比妥钠肝素溶液,将小鼠进行麻醉以及肝素化。小鼠固定后,由剑突下开胸并迅速分离心脏。将心脏置于4℃Krebs-Henseleit(KH)液中清洗并分离主动脉。将主动脉连接到Langendorff离体心脏灌流系统,以恒温(37℃)KH缓冲液进行灌流。切开左心耳,将充水的乳胶球囊插入,另一端连接压力转换器,并由Labchart对信号进行分析。将心脏固定到Langendorff离体心脏灌流系统后稳定20 min,继而根据分组不同用含有4-HNE或者安慰剂的KH液进行灌流。稳定灌流1 h后收集心脏。4.心功能的检测:用小动物心脏超声机检测小鼠心脏LVFS,LVEF指标,反应检测小鼠MIRI后24 h心功能情况。5.心梗死面积和缺血危险区检测:心脏MIRI取材后,采用伊文氏蓝(Evansblue,EBD)和 2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)的方法观察心肌缺血危险区和梗死区。6.血浆乳酸盐脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)检测:用EDTA抗凝采血管采血,将全血在4℃以2500 g离心15 min,收集上清后使用相应ELISA试剂盒检测。7.心肌细胞坏死检测:心肌组织中采用EBD和微囊蛋白(Caveolin 3,CaV3)联合免疫荧光染色法测定坏死细胞。8.免疫组化:心脏组织经石蜡包埋切片后,经烤片、梯度酒精脱蜡后,牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)封闭后,一抗、二抗孵育。最后3,3氮二氨基联苯胺盐酸盐(3,3N-diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)显色后苏木素染核。显微镜观察后拍照分析。9.蛋白检测:提取30μg蛋白后,利用10%-15%SDS-PAGE电泳、转膜、一抗、二抗孵育后进行检测。10.免疫共沉淀:通过免疫共沉淀的方法检测蛋白-蛋白之间相互作用。通过正常步骤提取蛋白后,将蛋白先后和一抗、beads共同孵育。孵育结束后,离心弃上清,加入稀释好的1xloadingbuffer,加热后同上蛋白检测步骤进行检测。11.mRNA检测:取心肌组织中RNA,通过RT-qPCR进行检测。12.统计分析:计量资料数据以均数±标准误(MeanSEM)表示,应用GrapPad Prism软件对面积大小、分子表达、活性等数据进行统计学分析,包括t检验、方差分析等,P0.05为差异具有统计学意义。(二)细胞实验1.细胞实验方案:为了研究4-HNE对于MIRI中细胞程序性死亡的作用及其机制,我们使用H9c2细胞并给予不同浓度和不同时间梯度的4-HNE刺激,检测了细胞程序性坏死以及程序性坏死通路相关蛋白的调节情况。为了确定4-HNE是否通过RIP1蛋白来调节MIRI中的细胞死亡,我们使用RIP1蛋白的小干扰RNA,之后再检测细胞坏死情况以及程序性坏死通路上相关蛋白的调节情况。之后为了明确,4-HNE是如何调节RIP1蛋白含量的,检测了 RIP1蛋白的mRNA水平以及蛋白代谢率还有其泛素化修饰情况。2.细胞4-HNE处理:细胞饥饿12 h后根据实验目的给予不同浓度4-HNE(20μM,40 μM,60 μM,80 μM)培养 1-6 h,收取细胞。3.细胞缺氧/复氧(H/R)模型建立:细胞饥饿12 h后放入缺氧培养箱(气体成分为94%氮气+5%二氧化碳+1%氧气)进行缺氧处理。将细胞缺氧培养12 h后,在正常条件下再培养1-6h,收取细胞。4.心肌细胞坏死检测:对于心肌细胞,用Annexin V/PI染色后用细胞流式分析仪分析测定坏死细胞。5.通过小干扰减少小鼠体内RIP1蛋白:通过对细胞转染RIP1小干扰,减少RIP1蛋白含量。6.蛋白检测和免疫共沉淀:同动物实验。7.统计分析:同动物实验。研究结果1.MIRI增加了小鼠心脏中的细胞程序性坏死和4-HNE产生EBD-CaV3双染结果显示,MIRI后,心肌坏死面积增加。此外,体内体外结果显示坏死通路 RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII在MIRI后均升高。同时,我们用免疫印迹的方法和免疫组化的方法证明了 MIRI后心脏组织处4-HNE的上升。在细胞实验中也应证了这个结果。2.减少4-HNE水平可以减轻MIRI中的程序性坏死在ALDH2-Tg小鼠中,MIRI损伤后4-HNE含量下降。同时,ALDH2-Tg可以改善MIRI后心功能。此外,ALDH2过表达可以减少MIRI后心梗面积和血浆LDH含量。EBD-CaV3染色显示MIRI后心脏坏死面积在ALDH2-Tg小鼠中缩小。与此同时,RIP1,p-RIP1,RIP3,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,p-CaMKII也在ALDH2-Tg小鼠中下降。免疫共沉淀显示,MIRI后坏死小体的形成也在ALDH2-Tg小鼠中下降。3.在离体灌流模型中,4-HNE刺激增加离体心脏中的细胞程序性坏死免疫组化以及免疫荧光显示在4-HNE灌流的心脏中,4-HNE的含量明显上升。此外,LVDP,dp/dt结果显示4-HNE灌流后心功能下降。同时,免疫印迹显示 4-HNE 灌流增加了心脏组织中RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和p-CaMKII的蛋白含量以及坏死小体的形成。4.4-HNE刺激增加H9c2细胞的程序性坏死细胞流式结果显示,4-HNE刺激后造成H9c2细胞坏死增加。同时不同时间梯度4-HNE进行刺激时,RIP1,p-RIP1,和p-RIP3呈梯度递增。而以不同浓度4-HNE 刺激时,RIP1,p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL,和 p-CaMKII 呈梯度递增。5.4-HNE刺激对心肌程序性坏死的调节是通过RIP1介导的为了明确RIP1蛋白的作用,用RIP1小干扰减少RIP1蛋白表达。细胞流式术显示减少RIP1蛋白可以减低4-HNE刺激下细胞程序性坏死的发生。通过蛋白免疫印迹法也可发现4-HNE刺激下p-RIP1,p-RIP3,MLKL,p-MLKL和p-CaMKII等蛋白的上升可以被RIP1 siRNA减弱。6.4-HNE刺激可以减少RIP1蛋白的泛素依赖性降解RT-qPCR发现4-HNE刺激后RIP1 mRNA含量没有明显改变。用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)抑制DNA转录后发现4-HNE可以减少RIP1蛋白的降解。同时蛋白共沉淀检测RIP1蛋白的k-48多聚泛素化发现4-HNE可以减少RIP1的K-48多聚泛素化修饰。同时我们检测了 cIAP1,cIAP2E3泛素连接酶和RIP1蛋白的结合,发现4-HNE并不影响RIP1蛋白和泛素连接酶之间的结合。因此可以推断4-HNE可以减少RIP1和泛素之间的结合。同时,4-HNE可以使RIP1蛋白的羰基化修饰增加。研究结论1.4-HNE可以增加MIRI中细胞程序性坏死。2.4-HNE通过提高RIP1增加MIRI中细胞程序性坏死。3.4-HNE通过减少RIP1蛋白的K-48多聚泛素化依赖性途径降解,增加细胞程序性坏死。