肿瘤坏死因子基因多态性Graves病相关性研究

【摘要】：Graves病(GD)是一种常见的自身免疫性内分泌疾病,其确切的发病机制目前尚未完全阐明,因而缺乏有效的病因治疗方法。自身免疫是一种复杂的病理生理过程,其发生发展有赖于遗传因素与环境因素之间复杂的相互作用。细胞因子是由免疫细胞产生的一组调节细胞功能的高活性、多功能的免疫介质,目前研究证明多种细胞因子如干扰素(IFN)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF)等通过调节甲状腺细胞与免疫细胞之间的相互作用及改变甲状腺细胞与免疫细胞的功能参与了GD的发生与发展,TNFα是一种重要的细胞因子,多种研究证明TNFα在GD的发生发展中发挥重要作:应用逆转录聚合酶链反应技术及免疫组化方法可在GD患者的甲状腺及眼球后组织中检测到TNFα及其mRNA表达;TNFα可使GD患者的甲状腺细胞、眼球后脂肪细胞、成纤维细胞等人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ类分子、粘附分子、趋化因子及一些细胞因子表达增加,从而使免疫反应得以维持与加强;TNFα抑制钠碘同向转运蛋白(NIS)mRNA表达与蛋白质合成,从而抑制甲状腺吸碘并抑制甲状腺细胞合成与分泌三碘甲状腺原氨酸(T3)及四碘甲状腺原氨酸(T4);TNFα还通过影响FasL/Fas、sFas等表达而影响甲状腺细胞凋亡。人类TNFα基因存在着-308、-238、-276、-163、-857、-863、-1031、+70、+488等多个多态性位点,多态性与转录的研究证明TNFα多态性可通过影响TNFα基因的转录而影响TNFα的产量,从而影响对疾病的易感性。已有研究证明+488多态性位点与普通变异免疫缺陷病相关,-308多态性位点与多种自身免疫性疾病相关且有种族差异。目前TNFα基因多态性与GD易感性的关系尚不肯定,本研究采用序列 山东大学硕士学位论文 特异性引物聚合酶链反应技术(P CR一SSP)对TNFo+488、一308基因多态性与山 东汉族GD易感性的关系进行探讨。 对象与方法 一、对象 (1) GD组:参照《内科学》第五版和《协和内分泌代谢学》中GD的诊 断标准确定GD的入选条件为1)存在甲状腺功能亢进症状,伴或不伴突眼,触 诊甲状腺弥漫性肿大、甲状腺功能检查(时间分辨免疫荧光法):游离T3(FT3)、 游离T4(FT4)水平升高、高敏促甲状腺激素(sensive th”oid stimulating hormone,sTSH)水平降低。2)已确诊为GD,经治疗后缓解(中、小剂量抗甲状 腺药物短期内即出现甲状腺功能减退者除外)或未缓解。符合上述条件之一者入 选。根据1977年美国甲状腺协会推荐的标准将甲状腺相关眼病(TAO)分为班 级,大于等于I级确诊为TAO。对于入选者再根据性别、有无GD家族史、有 无1人O分为三个亚组。(2)对照组:健康对照入选条件为1)年龄12~75岁。 2)无GD、桥本氏甲状腺炎(HT)等甲状腺疾病及家族史。3)无其他自身免疫 性疾病及家族史。选取山东大学齐鲁医院无血缘关系的山东汉族患者及健康体检 者各100例。 二、方法 1、基因组DNA提取:抽取空腹血Zml,ACD液防凝,用DNA快速提取试 剂盒(山东大学医学院遗传学教研室提供)提取外周血白细胞DNA。 2、PCR一SSP技术扩增目的DNA片段:参照Fanning川的方法进行,引物设计 参照国外文献由上海生物工程有限公司合成。针对尸FNF。+488多态性位点设计 的两条3,末端序列特异性引物为+4889:5’一gCA TCe CCg TeT竹e Tee Ae, +488a:5’一gCA TCC CCg TCT竹C TCCAT:针对TNFQ一308多态性位点设计 的两条3’末端序列特异性引物为一3089:5’~ATA ggT TTr gAg 999 CAT Cg,一3O8a: 5’一ATA ggTT竹gAg 999 CAT CA;针对人生长激素内参照DNA扩增片段设计 的两条上下游引物为5’一gCC竹C CCAACC Arl,CCCTT,5’一TCA egg戌几,TCT gTT gTg rrl,I,C。总反应体积50林l,含1 oxbuffers林l,25mmo比MgCL:4林l, lommol几dN仰l林l,几qDNA聚合酶2.ou,DNA模板3卜l(约Zoong),25nuno比 TNF。目的DNA扩增片段上下游引物各1川,25mm。比人生长激素内参照DNA 山东大学硕士学位论文 扩增片段上下游引物各l林l。扩增条件:预变性950C 2 min;940C 1 min,55oC 455,72oC 1 min,共30个循环:最后720C延伸7 min。PCR反应在MJ Researeh Minicycle TM热循环仪上完成,PCR试剂由上海生物工程有限公司提供。 3、基因型确定:PCR产物经澳化乙锭染色,与DNA分子量标记物一起于 1%的琼脂糖凝胶电泳分离,紫外线透射灯下确定等位基因及基因型。DNA分 子量标记物由大连宝生物公司提供。 三、统计学处理 两组等位基因及基因型分布频率经Hard一weinberg平衡试验检验其是否具有 群体代表性,两组间及亚组间计数资料的比较经卡方检验。 四、结果 (一)PCR电泳结果:基因组DNA用以扩增TNF。+488、一308之间的目的 DNA片段及人生长激素内参照DNA片段。TNFo+488、一308每一位点的两条序 列特异性引物分别作为目的DNA片段的上游及下游引物不同组合,每一个DNA 标本有4种目的DNA片段PCR扩增体系:+4889*一3089、+4889”一308a、 +4ssa*一3089及+488a*一3osa。为证明扩增反应成功,每种pCR混合反应体系 内均含有人生长激素内参照引物。只有内参照DNA片段扩增成功,才说明PCR 扩增反应是成功的,以避免由于PCR混合反应体系本身有问题造成的目的DNA 片段扩增假阴性。每一种PCR混合反应体系反应产物经琼脂糖凝胶电泳