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农杆菌介导的玉米转化技术的改进及转betA基因玉米抗逆性分析

权瑞党  
【摘要】:基因枪轰击法和农杆菌介导法是植物遗传转化的两大主流方法。农杆菌介导法与基因枪轰击法、电穿孔法、PEG法等其它DNA直接转移方法相比具有很大的优越性,例如可以转移大片段DNA,整合的外源基因拷贝数较少,并且基因重排频率较低。玉米作为一种单子叶植物不是农杆菌的天然宿主,农杆菌介导的玉米转化难度较大,其发展落后于农杆菌介导的双子叶植物的转化,目前玉米遗传转化的常用方法在大多数实验室仍为基因枪轰击法。尽管农杆菌介导的玉米模式种质A188自交系和Hi-Ⅱ杂交种(来源于A188×B73)的转化获得突破,建立了高效的转化体系,但是具有生产价值的玉米骨干自交系大部分难以通过农杆菌介导法转化。而且随着玉米分子生物学的发展,玉米基因组学研究也需要一种高效的玉米遗传转化方法。因此,建立农杆菌介导的玉米骨干自交系高效遗传转化体系不仅具有理论意义,而且具有重要的实用价值。 在本研究中,以农杆菌LBA4404侵染玉米骨干自交系齐319、掖515、掖502、DH4866等胚性愈伤组织,经过潮霉素筛选后由抗性愈伤组织再生植株,自交结实。研究发现,侵染时农杆菌悬浮液浓度、共培养时间、真空渗入处理、愈伤组织部分酶解和超声波处理等能影响转化率。 农杆菌悬浮液浓度OD_(600)0.5-0.7,侵染5 min,共培养3-4天,掖515和齐319胚性愈伤组织的转化率较高(约6%)。而增加或减少农杆菌悬浮液浓度,延长或缩短共培养时间,转化率均降低。原因可能是增加农杆菌悬浮液浓度使吸附在愈伤组织上的农杆菌数目增加,延长共培养时间使农杆菌增殖增加,但同时伴随着玉米愈伤组织死亡率的增加;而减少农杆菌悬浮液浓度,吸附在愈伤组织上的农杆菌数目减少,玉米细胞转化率下降;缩短共培养时间可能造成农杆菌不能有效完成T-DNA的转移和整合过程。 农杆菌侵染玉米胚性愈伤组织时,在50kPa下真空渗入5min,掖515和


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