野生一粒小麦BAC文库的构建、鉴定及着丝粒重复序列的克隆

【摘要】：基因组学研究已进入后基因组学时代,即功能基因组学时代。在我国尽管水稻(Oryza sativa L. ssp. indica)基因组全序列测序刚刚完成(Yu et al, 2002),但总体上仍然处于由结构基因组学向功能基因组学过度阶段,在一段时间内我国基因组学的研究仍将停留在起步阶段,如BAC 文库的构建及基于BAC 的物理作图等方面的研究。小麦是世界和我国最重要的粮食作物之一,由于其庞大的基因组,致使其基因组学的研究滞后于拟南芥(Arabidopsis thalina)及水稻等模式植物的研究。本研究利用普通小麦的二倍体祖先野生一粒小麦为材料,构建BAC 文库,目的是为开展小麦基因组学的研究奠定一定的技术平台。 构建大片段DNA 文库的关键技术包括载体和大片段DNA 的制备两个方面。大量转化后,得到了约20 万个克隆,15 360 个克隆以单菌落的方式存于40 块384 孔板中,组成单克隆文库,其余以混合池的方式存放于6 块384孔板中。本文库插入片段平均为104 kb,以野生一粒小麦基因组5 600 Mb计算,该文库共覆盖了3 倍以上的基因组,筛选到任一基因的可能性大于90%,另外分别用叶绿体基因psbA 及线粒体基因atp6 为探针,通过菌落杂交检测到细胞器DNA 的污染率低于1%。 用水稻着丝粒重复序列RCS1 为探针,与3072 个克隆进行菌落杂交,得到了32 个阳性克隆,用RCS1 与拟斯卑尔脱山羊草着丝粒重复序列Tcs250为探针进一步筛选,在32 个RCS1 相关的阳性克隆中任选10 个克隆进行点杂交,分别有6 个和5 个阳性克隆。为了克隆RCS1 相关片段,依据RCS1的序列设计了三对引物,将引物3 从上述阳性克隆中扩增的一个600 bp 的片段克隆测序,发现与RCS1 部分片段达到约83%的同源,与大麦的反转座子(Ty3/gypsy)部分序列同源性达到了92%,与节节麦中着丝粒的整合酶基因部分序列同源性达到了96%,命名为TBRCS1。TBRCS1 可能是野生一粒小麦着丝粒区的组成部分。