家蝇抗菌肽基因的表达模式与重组表达

【摘要】：自然界中大多数多细胞生物都生活在与病原微生物经常接触的环境中。这些生物的生存依赖于体内多种成分参与的宿主防御体系。高等脊椎动物的宿主防御依赖于两种类型的免疫反应:天然免疫和获得性免疫。而在昆虫等无脊椎动物中,宿主防御仅仅依赖于天然免疫。 天然免疫的一个主要机制为在生物体内组成性或诱导性表达一些内源肽,它们构成了机体防御病原体的快速而高效的手段,这些肽被称为抗菌肽。抗菌肽构成了原始的免疫反应机制,在从人到植物再到昆虫的真核生物中广泛存在,一些微生物中也出现了它们的踪迹。抗菌肽具有分子量小、等电点高、热稳定好、在生理条件下多数带正电荷、广谱抗菌等特点。它们不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用,对某些真菌、原生动物,尤其对耐药性细菌也具有杀灭作用。随着新的疾病不断产生,细菌的抗性已成为医学中不断增加的威胁。由于抗菌肽具有广谱的抗菌活性,被认为是解决病原微生物对抗生素不断增强的抗性问题的很好选择。一些抗菌肽还表现出了抗肿瘤、抗病毒和防治寄生虫传染病方面的应用潜力。在治疗HIV等性传播疾病方面也展现出了良好的应用前景。在农业生产中,它不仅可以用于动物饲料和食品保鲜,将抗菌肽基因转入动物和植物体中可以有效地防治一些病害的发生。人们对于抗菌肽的广泛研究还增加了人们对于先天性免疫系统的认知。因此,对抗菌肽的研究具有重要的理论意义和应用价值。 家蝇与人类的生活密切相关。家蝇从幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境里,是许多病原体的携带者,约100多个引起人类和动物疾病的病原体与家蝇有关,包括伤寒、霍乱、杆菌性痢疾、肺结核、炭疽热、婴儿腹泻和一些寄生虫病等。由于家蝇自身不受这些病原微生物的感染,人们推测家蝇体内具有独特的免疫防御机制,体内可能产生活性较强的抗菌肽。我们实验室曾从家蝇中纯化到1条分子量为10KDa的抗菌肽,它具有热稳定性,100℃加热10min仍有活性,表现出抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的潜力。之后,我们实验室从家蝇中克隆出1条防御素基因(GenBank no.AY260152),命名为家蝇防御素Md defensin(Mdde),和1条天蚕素基因(GenBank no.AF416602),命名为家蝇天蚕素Md-Cecropin(Md-Cec)。其它学者还从家蝇中克隆出了家蝇攻击素基因(GenBank no.AY460106和GenBank no.DQ062744)。 本研究应用RT-PCR和原位杂交技术研究家蝇抗菌肽基因在家蝇体内的表达模式,对比经微生物诱导前后,以及诱导后不同时间家蝇体内抗菌肽基因表达量的变化,调查抗菌肽基因在家蝇体内的组织分布情况。并应用RT-PCR克