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顶头孢霉的遗传育种方法初步研究和头孢菌素C发酵行为突变筛选

吴晓良  
【摘要】: 本论文主要研究了顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的遗传育种方法以及通过这些方法对顶头孢霉产生头孢菌素C的能力进行改良。全部工作主要分为三个部分: 首先,利用传统菌株改良技术(classical strain improvement,CSI)对顶头孢霉原始菌株进行改良,以不同的选择压力,获得不同优良性状的改良菌株。在本部分工作中,经过递归诱变和筛选,共获得了80株突变株,经发酵检测和性状分析,其中的3株突变株性状明显优于原始菌株,分别为:头孢菌素C的产量最高提高了33%,合成峰值时间提前了20h和节孢子生成能力提高50%。 其次,以获得的突变株为出发菌株,运用Genome Shuffling技术,将这些突变株进行递归融合,并进一步用压力进行筛选,最终将突变株的性状整合至同一株融合子中。在本部分工作中,首先对顶头孢霉的原生质体制备与再生工作进行了优化,确定了双亲灭活的融合方法;然后运用Genome Shuffling技术,将获得的3株突变株进行了递归融合,共进行了4轮融合,每轮筛选丙二酸耐受融合子100株,共计400株,挑取其中分化时间提前的融合子,并分析产量,其中11株产量显著增加。进一步的分析表明,其中一株融合子具备了3个亲本的性状。 最后,从分子水平对获得的融合子进行遗传操作,通过构建质粒并转化顶头孢霉的方式,解除了底物竞争抑制和表达了外源蛋白—血红蛋白(VHb),从而提高头孢菌素C的合成能力和菌丝体在低溶氧条件下的摄氧能力。在本部分工作中,构建了含有潮霉素抗性标记的VHb表达载体pANCVHb,然后在该质粒上插入了含有部分顶头孢霉lys基因片断的序列,构建了表达载体pANCVHb-lys。在获得的11株转化子中,约有3株产量提高了10%,在低溶氧条件下,70%的转化子的生物量提高了10%~15%,初步证明底物的反馈抑制得到了解除以及VHb得到了表达并具有活性。


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