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上皮根鞘和上皮剩余在牙齿发育过程中的生物学性状和作用研究

于西佼  
【摘要】: 目的: 赫特威尔氏上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)是牙根发育中的决定性结构,是牙根发育过程中上皮-间充质所发生的一系列交互信号诱导得以实现的重要且唯一的上皮性结构。断裂后的HERS细胞部分转移到了牙周膜内聚集成条索或簇形成上皮剩余(epithelial cell rests of Malassez,ECRM),在牙齿发育完成后的牙周组织中一生都存在。HERS及其断裂后产物上皮剩余在牙根发育特别是牙骨质发育和牙周组织内环境维系中的可能发挥重要作用,因此,上皮根鞘和上皮剩余的具体生物学性状及作用研究可能为解决牙周再生的瓶颈—牙骨质再生提供了新的希望和途径。 本课题研究上皮根鞘细胞的发生,非胶原基质蛋白骨桥素(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)及牙骨质发育之间关系。观察牙根发育中上皮根鞘断裂后结局和增殖凋亡相关基因的表达,探讨上皮根鞘在牙根发育特别是牙骨质形成中的可能作用。追踪观察上皮剩余在牙齿萌出和建(牙合)过程中的形态分布和细胞活性改变,从而探讨上皮剩余在牙根发育特别是牙骨质形成过程中的可能功能。 方法: 不同发育期SPF级BALB/c小鼠(山东大学动物中心提供)96只。戊巴比妥钠(3%,3 mg/100g)腹腔麻醉后新鲜配置4%多聚甲醛循环内固定30 min,分离双侧下颌骨4℃下再固定24h、10%EDTA脱钙30-60d,梯度乙醇脱水、石蜡包埋,近远中向5μm连续切片,行HE和免疫组化染色。 1.光镜观察 细胞角蛋白14(cytokeratin 14,CK14)标记上皮根鞘和上皮剩余细胞。建立牙根发育和牙周组织发育模型,光镜下,观察牙根发育过程中,上皮根鞘的发生、延伸及牙骨质的形成;观察上皮根鞘的断裂与上皮剩余的形成,建(牙合)期上皮剩余的形态及分布改变。 2.超微结构观察 透射电镜观察牙根发育不同阶段上皮根鞘和上皮剩余细胞的超微结构。 3.细胞凋亡和细胞增殖活性检测 TUNEL(TdT-mediated-dUTP nick end labeling,TUNEL)法原位细胞凋亡检测牙根发育中上皮根鞘和上皮剩余细胞凋亡的情况。细胞增殖采用PV免疫组化两步法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在两种细胞中的表达。 4.免疫组化检测凋亡基因和骨形成相关蛋白的表达 PV免疫组化两步法检测凋亡抑制基因Bcl-2、OPN、BSP在牙根发育中各组织中的表达。 5.计算机三维重建上皮剩余在建(牙合)期的形态和布局。 6.统计分析采用Newman-Keuls法计算建(牙合)前期、建(牙合)期及建(牙合)后期上皮剩余细胞数量差异是否存在统计学意义,取α=0.05水准。 结果: 1.小鼠出生后第5天,内外釉上皮颈环处融合增殖形成上皮根鞘,细胞呈PCNA表达阳性,免疫组化结果显示新形成上皮根鞘细胞呈OPN阳性表达,但未见BSP阳性表达。在牙根的发育过程中,OPN在牙本质牙骨质界处有较高表达,伴随牙骨质基质不断在根面沉积形成,OPN在牙骨质中表达增强,成熟牙根表面可见厚度不同的牙骨质覆盖,呈OPN阳性表达。超微结构观察发现,内外釉上皮在融合过程中,两层细胞之间包含个别具有丰富细胞器的一类细胞,其胞浆中可见大量的高尔基复合体和粗面内质网,通过桥粒与内外釉上皮连接。此时内外釉细胞胞浆中可见到粗面内质网和较多的线粒体。 2.牙根发育开始后,HERS呈Bcl-2阴性表达,在少量牙本质基质形成处,HERS细胞开始呈TUNEL阳性表达,之后HERS断裂,在其外侧可见成牙骨质细胞的形成,断裂的HERS细胞部分转入牙周膜形成上皮剩余,而细胞牙骨质形成中可见部分埋入细胞呈CK14阳性表达。牙根发育过程中,根面上即将发生断裂HERS的内侧细胞胞内可见丰富的粗内内质网和一定的线粒体,线粒体出现体积膨大、线粒体嵴减少,但HERS根面侧与牙根面基质成分之间可见较多平行于根面的纤维束分布。 3.自牙齿萌出前到建殆后期上皮剩余的外形和分布改变明显,建殆后期上皮细胞簇更为规则的,分布由牙根表面的较广泛分布向根分叉和牙颈等部位局限,与成熟期上皮剩余相似。小鼠出生约第19-25天,下颌第一磨牙建殆阶段,上皮剩余沿牙根表面呈现类网格样布局,细胞数量较萌出前期明显增加,细胞增殖活性检测显示此时上皮剩余特别是根分叉水平细胞增殖活跃。建(牙合)后期上皮剩余细胞数量开始减少,透射电镜结果显示较多的簇内出现细胞调亡征象。 结论: 1.上皮根鞘发生时,内外釉上皮间可包容个别源于网状层或中间层的含丰富细胞器的细胞,从而形成类似成釉器的结构,其可能在牙根发育起始阶段分泌某些蛋白和信号分子启动根部牙本质和牙骨质的形成。此外,OPN不仅是牙骨质的基质蛋白,在牙本质牙骨质界形成中可能也具有一定作用。 2.HERS细胞的凋亡可能会为成牙骨质细胞分化提供信号,部分HERS细胞可能参与牙骨质的形成。 3.建(牙合)期上皮剩余包绕牙根的特殊布局及其在建(牙合)过程中的形态和细胞活性改变提示上皮剩余不是仅仅作为无功能的“剩余物”,其可能是上皮根鞘功能的衍伸或持续,在建(牙合)过程中发挥积极作用从而完成牙周组织的发育和牙周内环境稳定的形成。


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