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Rapamycin对同种移植耐受模型中CD4~+ CD25~+调节性T细胞活性影响的实验研究

郑永先  
【摘要】: 研究目的CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)是近来发现的具有强有力免疫负调节作用的T细胞重要类型之一。最近研究显示,Treg参与多种途径诱导的移植免疫耐受。因此深入研究影响和调控Treg活性的因素及其机理,对诱导移植耐受,从根本上解决临床器官移植排斥问题,具有重要意义。然而目前临床广泛应用于器官移植的免疫抑制剂对CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响及其机理尚不明确。Rapamycin(雷帕霉素,Rapa)作为一种新型大环内酯类免疫抑制剂,其独特的免疫抑制作用在器官移植领域已经受到高度重视。近来研究报道Rapa在体外可以选择性地扩增正常小鼠的天然CD4~+CD25~+调节性T细胞,而不阻断该小鼠CD4~+T细胞的扩增和活化诱导细胞凋亡,但其确切机制尚不清楚。此外,有研究报道,IL-2作为一种经典的T细胞生长因子,同时也调控调节性T细胞诱导免疫耐受的过程,影响调节性T细胞的功能并维持其竞争适应性。但是在移植耐受诱导过程中IL-2与Rapa之间有无相互作用尚不清楚。 本实验室前期研究发现,在传统免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)诱导的同种移植耐受模型中,CD4~+CD25~+Foxp3~+表达升高,并与移植物生存时间呈正相关。但是Rapa是否也影响同种移植个体的Treg活性,能否在体外扩增移植耐受模型的CD4~+CD25~+调节性T细胞并保持其免疫抑制活性方面,目前尚未见研究报道。本实验采用小鼠同种皮肤移植模型,以Rapa/CsA对同种移植模型进行耐受诱导。研究Rapa体外对移植耐受模型中CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg活性的影响。同时研究在不同剂量IL-2存在条件下,Rapa介导同种皮肤移植免疫耐受的有效方式和使用剂量,并研究经Rapa处理的耐受模型的CD4~+ T细胞对介导过继移植免疫耐受的应用效果。 实验方法 以B6小鼠为供体,BABL/c和BABL/c-SCID小鼠分别为受体,建立小鼠同种皮肤移植模型。移植术前一天供体脾细胞预先注射,移植后BABL/c小鼠分别给予免疫抑制剂Rapa(0.5mg/kg)或CsA(10mg/kg)腹腔注射进行耐受诱导。移植后第14天提取耐受诱导的BABL/c小鼠脾细胞(术后第14天对照组移植皮片全部排斥),纯化T细胞和CD4~+T细胞,经不同浓度Rapa和/或IL-2体外处理后,通过MLR确定T细胞特异性回忆反应;流式细胞术检测CD4~+CD25~+Treg细胞比例变化;RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况;ELISA检测T细胞培养上清中IL-10浓度的变化。然后将经过Rapa体外处理的CD4~+T细胞过继转输给BALB/c-SCID小鼠同种移植模型,逐日观察移植物存活状态。 实验结果 1.与对照组相比(13.2±1.5d),移植后体内应用雷帕霉素加供体脾细胞预先注射,移植皮片存活期明显延长(22.8±2.1d),P<0.05。CsA加供体脾细胞预先注射,移植皮片存活期也明显延长(22.0±1.9d),与Rapa处理组相比无显著差异,但是小鼠的一般状况较差,体重明显下降。 2.移植耐受模型鼠的T细胞经Rapa体外处理不同时间(24、48、72、96h)后,与未处理组相比,Rapa单独处理在第72h可以使T细胞特异性增殖水平降低,联合IL-2共同处理时T细胞特异性回忆应答反应最弱。同期T细胞培养上清中IL-10水平与T细胞特异性回忆反应的变化一致。 3.移植后第14天耐受模型组提取的T细胞或CD4~+T细胞经低浓度Rapa(100nM)体外处理72h后,与未经Rapa处理的对照组相比,CD4~+CD25~+T细胞数量增多,Foxp3表达量增加,而联合低浓度IL-2(50IU/ml)后其上调CD4~+CD25~+T细胞数量的比例较二者单独应用均明显提高。 4.耐受模型小鼠脾CD4~+T细胞经Rapa体外处理后再过继转输给同种移植的BALB/c-SCID鼠后,其移植皮片存活时间显著延长(P<0.05)。 结论 1.体内应用Rapa或CsA加供体脾细胞预先注射均可明显延长同种移植皮片的存活时间,诱导移植耐受,Rapa效果优于CsA。 2.Rapa体外处理同种移植耐受模型鼠T细胞和CD4~+T细胞的有效使用剂量是100 nmol/L,最佳作用时间是72h。 3.Rapa在体外可以扩增移植耐受模型中CD4~+CD25~+T细胞的数量,增加Foxp3表达量,低浓度IL-2(50IU/ml)可以协同增强Rapa这一作用。 4.Rapa诱导的Treg其功能的发挥不依赖于IL-10的产生,但其功能的激活有赖于IL-2的存在。 5.耐受诱导产生的CD4~+CD25~+Treg,经Rapa体外处理后过继转移,仍保持其免疫负调节作用,明显延长同种移植物存活时间。


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