收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

重组组织型纤溶酶原激活剂变异体(RETEPLASE)工程菌的培养与体外复性的研究

孔扬  
【摘要】: 目前,蛋白质作为新兴的大分子药物正进行着前所未有的研究和开发。通过重组DNA技术,可以使目的基因有效的在异源宿主细胞中实现转化和表达,但宿主细胞对于重组蛋白的数量和质量有较大影响。由于原核细胞和真核细胞在蛋白的翻译、翻译后修饰以及折叠的机制不同,因此在细菌宿主如大肠杆菌(Escherichia coli)中生产动物蛋白常常无法获得可溶的、有天然活性的蛋白。 Reteplase(中文商业用名瑞替普酶)是第三代溶血栓药物,该产品不但生产工艺简单,在临床上更具有药物半衰期长、溶栓作用强、副作用小等优点。Reteplase是组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的衍生体,在t-PA分子原有结构的基础上进行了功能域的删除,保留了kringleⅡ、蛋白酶两个功能域及N端的3个氨基酸;该重组突变体是单链非糖基化蛋白,由355个氨基酸组成,分子量约为39 kD,含9对二硫键,是一种在体外很难复性的蛋白。 尽管现已发现不少表达宿主,当目的产物的功能不依赖于糖基化修饰时,E.coli仍然是首选的表达系统。在E.coli中,目的蛋白能够在很短的时间内实现高水平表达,但多数情况下,表达产物在胞内以无活性的聚集物——包涵体的形式存在。为减少包涵体聚集,促进目的蛋白尽量以具有天然活性的形式表达,目前已尝试过多种方法。我们尝试用不同的表达体系,包括真核系统毕赤酵母(Pichia pastoris),在E.coli中用含有信号肽的质粒将目的蛋白在细胞周质中表达,然而,以天然活性形式表达蛋白的效果并不令人满意。因此,以包涵体的形式生产蛋白更容易为人们接受,因为包涵体可以很容易的分离而且含高水平具有正确一级结构的蛋白。其中,体外复性的过程是关键所在,通过对每一步精细设计,可使其更具可操作性。如能开发出有效的复性工艺,利用包涵体蛋白可以获得满意的产量。这是我们利用E.coli BL21菌株和含有T_7强启动子的pET22b质粒,以包涵体的形式生产Reteplase的主要原因。通过体外复性产生有活性的天然蛋白是这项工作的关键。 以包涵体形式表达目的蛋白时,包涵体蛋白表达量高,且能抵御蛋白酶的水解。当目的产物对宿主有毒性或具致死性时,选择以包涵体的形式表达目的蛋白将是非常可行的。生产包涵体的工程菌培养条件优化比生产可溶蛋白的工程菌培养条件优化要简单。在发酵培养中,我们对诱导剂IPTG的浓度、诱导时间、葡萄糖浓度对诱导的影响、培养温度和溶氧等条件进行了摸索。实验结果表明,IPTG浓度为80μM,诱导后培养时间4~5 h,葡萄糖浓度控制在0.1 g/L以下,培养温度40℃,溶氧保持在20%为培养的最佳条件。在2L的发酵罐重复实现了菌密度OD值40和包涵体蛋白表达率约30%的结果。包涵体经过简单的洗涤纯化,可以获得纯度85%以上的包涵体蛋白,用于后续的复性。蛋白质的体外复性是一个复杂的过程,需要精心设计。一旦高表达的包涵体蛋白可以有效转化成为可溶的活性蛋白,此项工作将变得更有意义。 我们应用了三种原理不同的方法对Reteplase进行体外复性。1、传统的稀释复性。在复性缓冲液中加入GSH/GSSG对,促进二硫键的形成,并添加L-精氨酸来抑制聚集。2、二硫键异构酶(PDI)辅助复性。3、色谱法辅助复性,主要利用改良的分子排阻凝胶色谱辅助复性。 将变性蛋白在大量的复性缓冲液中稀释是最常用的方法。但低蛋白浓度和巨大的反应体积是其工业化放大过程主要的问题。对稀释复性的各种条件进行了优化,如蛋白浓度、GSH/GSSG浓度和比率、L-精氨酸的浓度、复性时间。在蛋白终浓度0.1mg/ml条件下获得复性率2%。二硫键异构酶(PDI)能催化天然二硫键的形成,而这通常是折叠过程中的限速步骤。PDI还具有分子伴侣的功能,能够抑制聚集。我们以稀释复性缓冲液为基础,调试不同PDI与目的蛋白摩尔浓度,获得了复性率13.2%的结果。从整个工艺的成本考虑,操作中必须加入额外的分离步骤,并且重复使用分子伴侣也是一个障碍。分子伴侣和折叠酶与蛋白的有效作用必须符合化学计量关系,这种特性也增加了产品的成本,就目前来看,很难用于大规模的工业生产。 利用层析柱对包涵体蛋白辅助复性相对于传统的复性是一种很好的替代方法。这种方法是利用现有的色谱技术提高蛋白正确折叠。它具有以下优点:1放大不走样,从小试到规模化生产使用的技术与获得的产率大致相同。2容易自动化,确保迅速和高通量处理样品。3对于结构相似的蛋白具有通用性,工艺不需重新改造便可应用于新基因序列。我们比较了各种层析法复性的原理,根据现有的实验条件,将分子排阻色谱法(SEC)应用于Reteplase辅助复性。 我们利用改良的分子排阻色谱对Reteplase进行复性,以G25-M为填料;分别在SEC柱中形成变性剂梯度、pH梯度、变性剂梯度和pH双梯度,以促进蛋白复性率提高。分别对上样量、流速进行优化,可以获得优于稀释复性的结果。其中变性剂梯度和pH双梯度SEC对复性率的提高最为明显。在上样蛋白浓度4mg/ml,洗脱流速0.4mL/min时,复性率达到9.2%,(蛋白最终浓度0.32mg/ml),复性率高于宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)同类产品。宝灵曼公司主要利用稀释法复性Reteplase,复性率约5%;并且采用分子排阻色谱辅助复性对样品的纯度要求不很严格。 我们将ETI-Sepharose4B亲和层析柱,用来纯化Reteplase。刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂类,而Reteplase是精氨酸特征性的丝氨酸蛋白酶,它能被ETI作用点上的Arg63识别并产生可逆性结合;据此可以用ETI作为亲和填料来纯化Reteplase。利用酵母工程菌株制备了ETI蛋白,并与Sepharose 4B偶联,制成ETI-Sepharose4B亲和层析柱,得到很好的纯化效果。 最后对本论文进行总结与展望。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 赵喜红;何小维;李文美;杨连生;王继华;彭运平;刘晓云;;大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展[J];食品工业科技;2010年06期
2 张婷婷;叶波平;;包涵体蛋白质的复性研究进展[J];药物生物技术;2007年04期
3 郭井利,彭永刚,刘鹏,孙文毅,刘冰;重组蛋白在大肠杆菌中包涵体蛋白的表达及其复性[J];畜牧兽医科技信息;2005年08期
4 邹平;;重组包涵体蛋白质复性[J];厦门科技;2005年05期
5 彭凌;朱必凤;刘主;;包涵体复性研究[J];韶关学院学报;2007年09期
6 李军;刘美杰;李勇;窦忠英;;重组蛋白包涵体的研究进展[J];安徽农业科学;2008年31期
7 于文国;陶秀娥;;包涵体蛋白复性及其影响因素[J];河北工业科技;2007年05期
8 傅晶晶;孙静;陈佩;霍烛;范文玲;郝彦玲;刘勇;;HIV-1 Gag蛋白在大肠杆菌表达系统中诱导和纯化条件的优化[J];生物工程学报;2008年07期
9 高飞;范清林;邹文艺;宋礼华;;包涵体蛋白的层析复性技术研究进展[J];生物技术通报;2006年02期
10 王增;马会勤;张文;陈尚武;;包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展[J];中国生物工程杂志;2009年07期
11 刘晓飞;裴剑竹;杜国俊;杨章民;;蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展[J];中国生物工程杂志;2011年03期
12 黄东健;姚忠;刘步云;吴明刚;邓海霞;;重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的稀释复性[J];生物加工过程;2008年03期
13 方敏,黄华樑;包涵体蛋白体外复性的研究进展[J];生物工程学报;2001年06期
14 罗惠霞;李敏;王玉炯;;包涵体蛋白复性的几种方法[J];生物技术通报;2007年05期
15 王骊丽;耿信笃;;源于大肠杆菌蛋白的表达、液相色谱复性与纯化新进展[J];中国科学(B辑:化学);2009年08期
16 李俊玲;王世立;韩金祥;王国栋;赵甜娜;;重组人成骨蛋白-1复性条件的优化[J];中国生物制品学杂志;2007年06期
17 易进华;张元兴;;融合牛肠激酶轻链EK_L包涵体蛋白的复性纯化[J];生物工程学报;2006年05期
18 杨晓梅;包涵体蛋白的复性技术[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2000年02期
19 朱希强,袁勤生;EC-SOD包涵体的柱上复性、纯化及稳定性研究[J];微生物学通报;2005年04期
20 宋江南;李校堃;苏志坚;吴志玲;黄亚东;;重组人TGF-β3的表达纯化及复性研究[J];中国生物工程杂志;2005年12期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王志珍;;巯基蛋白质氧化还原酶的折叠酶活性与其二聚化作用[A];第一届全国脑与认知科学学术研讨会论文集[C];2005年
2 曾丽玲;周筠梅;;C-domain对Trigger Factor体内分子伴侣作用的影响[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
3 于振行;汤洪敏;高丹;潘继承;周海梦;;SDS对精氨酸激酶的变性作用及人工分子伴侣帮助下的复活[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
4 李震宇;刘川鹏;朱榴琴;静国忠;周筠梅;;Trigger Factor体内分子伴侣作用与其PPlase活力无关而作用效果与其同底物的比例相关[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
5 刘越存;张玉虎;王丽娟;王丽敏;王艳艳;;分子伴侣辅因子CHIP与帕金森病PINK1基因的相互作用[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年
6 张颖;杨艺敏;胡林森;;PSI诱导PC12细胞的PD模型中分子伴侣家族的氧化修饰[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
7 熊晓然;岳大为;艾建宇;吴显辉;冯胜彦;陈蔚梅;郭明雄;吴斌;;大肠杆菌分子伴侣系统GroE的分子可及性研究[A];第九次全国生物物理大会学术会议论文摘要集[C];2002年
8 石毅;周筠梅;;疏水荧光探针bis-ANS对Trigger factor分子伴侣功能及二聚化的影响[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
9 于振行;朴龙斗;周海梦;;部分折叠肌酸激酶的聚沉及人工分子伴侣辅助的复活和再折叠[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
10 张森;李剑;王志珍;;一种非ATP酶依赖的GroEL的分子伴侣活力[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孔扬;重组组织型纤溶酶原激活剂变异体(RETEPLASE)工程菌的培养与体外复性的研究[D];山东大学;2005年
2 马雪梅;神经营养相关因子基因的克隆、表达及蛋白的纯化研究[D];中国协和医科大学;1997年
3 黄志锋;多聚化合物在提高蛋白质体外正确折叠及稳定性方面的作用及相关机制研究[D];南京理工大学;2010年
4 宋斐;HAb18G/CD147胞外片段蛋白质折叠复性研究[D];第四军医大学;2007年
5 王孟春;内质网分子伴侣家族成员在幽门螺杆菌感染胃粘膜中的表达及意义[D];中国医科大学;2002年
6 赵喜红;HIV结构蛋白重组表达复性及检测方法的研究[D];华南理工大学;2010年
7 杨怀宁;GICA一步法检测HIV和TP诊断试剂的研究[D];吉林大学;2008年
8 王敏;植酸酶PHYA的高效表达及二硫键的功能分析[D];山东农业大学;2008年
9 王振元;核因子-κB表达与体外循环脑损伤及术后神经精神功能障碍的关系[D];山东大学;2009年
10 胡荷宇;抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究[D];华中科技大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈望化;重组组织型纤溶酶原激活剂变异体(RETEPLASE)复性研究[D];山东大学;2006年
2 高飞;重组人干扰素α-2b包涵体蛋白的柱层析复性研究[D];安徽大学;2007年
3 张劲;截短型重组蛋白HLA-G1的原核表达纯化和共复性研究[D];西北农林科技大学;2006年
4 付敏玲;苹果酸脱氢酶包涵体的表达及复性研究[D];天津大学;2006年
5 谭培生;核糖核酸酶A的体外重折叠过程研究[D];浙江大学;2006年
6 李彦杰;人基质金属蛋白酶2(MMP-2)类血红素结构域原核表达、复性及生物学活性验证[D];西北农林科技大学;2006年
7 余秀娟;体外蛋白复性中小分子添加剂的作用及其过程分析研究[D];西北大学;2011年
8 王馥丽;高浓度rhBMP-2m复性条件的探讨[D];第四军医大学;2008年
9 陈丽君;金属螯合色谱耦合人工伴侣辅助EGFP包含体蛋白质复性[D];天津大学;2008年
10 王艳艳;溶栓新药瑞替普酶(Reteplase)变复性及分离纯化的研究[D];山东大学;2006年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 宋全政;真诚守护每一位师生的安全[N];中国教育报;2007年
2 王东;桃李满天下[N];科技日报;2007年
3 白向忠本报记者 王建梁;一路追着环保走[N];科技日报;2007年
4 本报记者 李德辉 通讯员 王静 实习生 王远;在产学研的广阔海洋纵横驰骋[N];联合日报;2006年
5 记者 宋全政通讯员 周大白 张果红;学生登台讲课 师生田间调研[N];中国教育报;2008年
6 本报记者 赵秋丽 通讯员 曹宪忠 冯刚;“文史见长”创优势[N];光明日报;2010年
7 记者 魏海政 宋全政;山东大学泰山学堂多次评价多次流动育英才[N];中国教育报;2010年
8 记者 孙明河魏东;“不辜负人民嘱托,坚决完成任务!”[N];科技日报;2008年
9 特约记者  鲁晓懋;老山东大学:东方瑞士的人文之脉[N];中国房地产报;2006年
10 记者  赵秋丽 通讯员  王秋生;山东大学:推进按大类招生,实施个性化培养[N];光明日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978