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新型生物靶向光敏剂酞菁锌介导的光动力疗法治疗CNV体内外实验研究

黄焱  
【摘要】: 第一部分ZnPcS_4-BSA介导的PDT对人视网膜色素上皮细胞的作用 目的:探讨四磺酸酞菁锌(ZnPcS_4)与牛血清白蛋白(BSA)的配合物(ZnPcS_4—BSA)介导的光动力疗法(PDT)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞的光敏化作用,为进一步研究ZnPcS_4应用于动物体内,及将来运用于临床CNV的治疗提供实验数据与理论基础。 方法:从原代开始培养人RPE细胞,传到2—4代的细胞用于本实验研究。首先用紫外可见光谱分析仪观察RPE细胞对ZnPcS_4和ZnPcS_4—BSA的摄取及代谢的规律,确定进行光照的最佳时间点。分为正常对照组、单独光敏剂组、单独光照组、根据激光能量密度分为50J/cm2、100J/cm2照射的PDT1组和PDT2组,光照后24小时观察细胞形态的变化,用MTT法计算光照对RPE细胞的抑制率。光照后1小时,装载DCFH—DA荧光探针,用荧光显微镜以及流式细胞仪观察和检测细胞内活性氧(ROS)的含量变化,装载JC—1荧光探针,用共焦激光显微镜以及流式细胞仪观察和检测细胞内线粒体膜电位的变化。用RT—PCR检测光照前后RPE细胞内PEDF和VEGF mRNA表达的变化,探讨PDT治疗对RPE细胞功能的影响。 结果:RPE细胞与ZnPcS_4—BSA共同孵育1、2、3、4、5、6、12、24小时对其摄取量分别为:0.39±0.01;1.42±0.03;3.16±0.03;7.66±0.07;6.74±0.05;3.54±0.04;0.45±0.01;0.12±0.01。与同时间点ZnPcS_4的摄取量比较有显著差异。ZnPcS_4—BSA介导的PDT1、PDT2照射的两组,用MTT计算光照对RPE细胞的抑制率分别为60.71%和90.48%,明显强于ZnPcS_4介导的两组(抑制率分别为38.10%和55.95%)。PDT1与PDT2组抑制率比较有显著差异。ZnPcS_4—BSA—PDT光照后,流式细胞仪测定RPE细胞内ROS含量分别为对照组(0.5±0.1)%,光敏剂对照组为(1.7±0.1)%,光对照组为(4.1±0.2)%,PDT1组(16.7±0.2)%,PDT2组(21.6±0.3)%,PDT的两组与对照组比较,差异有统计学意义。荧光显微镜观察PDT后RPE细胞绿色荧光增强,说明ROS明显增多。共聚焦激光显微镜下正常细胞的橘红色荧光明显减少,或者完全被绿色荧光取代,说明有线粒体膜电位下降的表现。ZnPcS_4—BSA-PDT光照后,RPE细胞PEDF mRNA表达减少而VEGF mRNA表达的量增加。 结论:1、RPE细胞对ZnPcS_4—BSA的摄取量明显高于对ZnPcS_4的摄取量,4小时达到高峰,24小时基本排泄干净,所以有代谢快的优点。BSA对ZnPcS_4在生物体内的转运和代谢有一定的辅助作用。2、ZnPcS_4—BSA-PDT光照后,RPE细胞内ROS含量显著增加,且以核周的荧光增强为主,且随着光照密度的增加而增加。同时有线粒体膜电位的下降或消失,提示线粒体途径是PDT诱导RPE细胞凋亡或坏死的主要途径。3、ZnPcS_4—BSA-PDT使RPE细胞形态结构改变,同时PEDF和VEGFmRNA表达的量改变,使得他们之间的平衡失调,这可能是PDT后CNV复发的机制之一,提示我们在PDT的同时给与PEDF将提高疗效,预防CNV复发。 第二部分ZnPcS_4-BSA在大鼠眼组织分布的研究 目的:观察新型生物靶向光敏剂酞菁锌(ZnPcS_4-BSA)在大鼠眼组织的分布特点,特别是在脉络膜和视网膜药物浓度高峰期及消退的时间,为今后应用酞菁锌光敏剂进行眼部光动力治疗提供依据。 方法:取健康BN(Brown Norway)大鼠28只,随机分成7组,对照组4只和实验组24只,戊巴比妥钠麻醉动物后,经尾静脉注入新型生物靶向光敏剂酞菁锌1.0mg·kg~(-1)和2.0mg·kg~(-1),对照组4只经尾静脉注入等量生理盐水,实验组分别在给药后5分、10分、15分、30分和60分钟各取4只大鼠眼球,作冰冻切片,迅速于荧光显微镜下观察前、后节的荧光分布,两人同时观察并确定荧光强度等级,然后同一张切片行HE染色明确组织层次。另4只给药后立即进行眼底血管造影观察。 结果:对照组眼球冰冻切片荧光显微镜下无荧光,注射光敏剂后脉络膜和外层视网膜均可见绿色荧光迅速增强,随时间推移荧光强度逐渐减弱,角膜、虹膜、晶状体、玻璃体、内层视网膜和巩膜在所观察时间内未发现药物荧光。给药后10-20min为光敏剂酞菁锌在眼组织分布的高峰期,30min后药物浓度有所下降,视网膜层仍有少量荧光,60min药物荧光基本已消退。 结论:荧光显微镜观察法可以比较全面、准确地观察药物在眼部各层组织的分布,静脉注射后光敏剂酞菁锌迅速分布于脉络膜和外层视网膜等,而无血管组织如角膜、晶状体等药物荧光检测不到。酞菁锌介导的光动力疗法治疗脉络膜新生血管最佳时间是给药后10-20min进行光照。 第三部分ZnPcS_4-BSA-PDT治疗大鼠脉络膜新生血管的研究 目的建立脉络膜新生血管(CNV)大鼠模型,探讨新型光敏剂ZnPcS_4-BSA介导的光动力疗法对脉络膜新生血管的疗效及应用前景。 方法雄性BN大鼠,36只(72只眼),每只大鼠一眼作为实验眼,另一眼作为对照眼,在间接检眼镜下用氩激光光凝视网膜,分别于光凝后7、14、21、28天时行眼底光学相干断层扫描(OCT)和荧光血管造影(FFA)等检查。光凝21天后,取有典型CNV的大鼠12只,进行光动力治疗(PDT),光敏剂的给药量是2.0 mg·kg~(-1),给药后10-15min光照,光照用670nm波长的激光,按照射能量密度为50J/cm~2、100J/cm~2分为的PDT1和PDT2两组,每组6只,分别于治疗后24小时和7天进行眼底镜,光学相干断层扫描(OCT)和荧光血管造影(FFA)等检查,检查后立即取眼球后段,作组织病理学光镜和电镜的观察。 结果光凝后7、14天时,OCT检查见光凝斑视网膜变薄,脉络膜反射被遮蔽,FFA见少量荧光素渗漏,光镜检查见视网膜神经层变薄。光凝21天后,OCT检查见光凝斑视网膜色素上皮(RPE)层和脉络膜毛细血管层反射光带增厚,光凝后21和28天时,FFA检查分别有55%和35%的光斑有点状荧光素渗漏,光镜检查有脉络膜新生血管形成。PDT1和PDT2组治疗后24小时FFA检查CNV各有30%和25%被封闭,7天后各有60%和70%,两组间总的有封闭率有显著性差异。光镜和电镜检查,PDT2组比PDT1组视网膜色素上皮细胞损伤更为严重。 结论1、一定能量的氩激光光凝能制作大鼠CNV模型,光凝后3周成模率最高,FFA结合OCT检查可作为鉴定是否有CNV形成的客观可靠的方法。2、ZnPcS_4-BSA介导的光动力治疗一周后能有效地封闭脉络膜新生血管。3、50J/cm2、100J/cm2不同能量照射的两组疗效无显著差异,但是,能量越大对RPE细胞损伤越大,提示我们选择合适的治疗能量是减少正常组织损伤的关键。


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