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骨髓单个核细胞移植治疗慢性心力衰竭的实验和临床研究

刘尊齐  
【摘要】: 近十年来,慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的治疗取得了很大进展,心功能不全的病程得到有效延缓,但其进程仍没能逆转,预后也不理想。由于药物疗效的局限性,人们在不断探索其他可能有效的CHF治疗方法。 体外实验证实成人骨髓干细胞可以分化为包括心肌细胞在内的各种其他类型的组织细胞,这促使人们将骨髓干细胞用于心力衰竭的治疗。Strauer首次证实骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)经冠脉移植治疗缺血性心肌病的可行性和安全性,随后对BMMNCs的研究取得了一系列进展,许多研究报道了自体BMMNCs移植治疗缺血性心力衰竭的良好效果。最近又有研究证实经冠脉注射BMMNCs治疗心肌梗死后心力衰竭不仅安全可行,而且可以改善症状、降低血清心房肽和脑钠素、增加心功能并可能延长患者寿命。BMMNCs移植正成为很有前景的治疗CHF新方法。 然而,也有学者否定骨髓干细胞可转化为心肌细胞,否定BMMNCs移植治疗CHF的疗效,对BMMNCs移植改善心功能的具体机制更是莫衷一是。我们在研究中发现心肌微小损伤在CHF的自发进展中具有重要的价值,本系列研究在观察BMMNCs移植治疗缺血性CHF的疗效及安全性的同时,重点研究BMMNCs移植对CHF心肌微小损伤和细胞凋亡等方面的影响,探讨BMMNCs移植治疗CHF的机制。 本文包括实验和临床两个部分,实验研究包括三方面内容:1.大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、体外扩增和纯化;2.大鼠CHF模型的制作;3.同种异体BMMNCs移植治疗CHF的实验研究。临床研究部分主要研究自体BMMNCs移植对CHF患者心功能及心肌微小损伤的影响。 论文1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、体外扩增和纯化 目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的提取、分离、培养、体外扩增和纯化的适宜条件,观察在体外培养时BMMSCs的生长状况和生物学特性。为临床进行干细胞移植治疗心肝脑等器官功能衰竭提供种子细胞。 方法无菌条件下取2月龄大鼠股骨和胫骨,采用断骨离心获取骨髓,通过密度梯度离心法(Percoll法)从骨髓中分离出骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs),用含15%胎牛血清的低糖DMEM进行培养扩增;胰酶消化传代,倒置显微镜下观察其生长状况。 结果体外培养的原代BMMSCs 48~72小时内可见少量贴壁细胞,8天左右开始融合。BMMNCs培养4天时形成由BMMSCs组成的细胞集落;5-12天时,细胞生长迅速,出现较大集落,呈贴壁生长,以集落生长的细胞生长速度显著快于散在生长的细胞;14天左右,细胞融合成单层,排列成漩涡状或放射状。用0.25%胰蛋白酶消化后传代培养,传代细胞增殖较快,约5天可传一代,传至3代时细胞基本被纯化,但随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢并出现多倍体核型。 结论经密度梯度离心法获取的BMMNCs内含有较多BMMSCs,利用贴壁培养方法可以很容易的对BMMSCs进行分离、培养、扩增和纯化,BMMSCs体外培养成功为细胞移植治疗器官衰竭提供了种子细胞。 论文2 大鼠慢性心力衰竭模型制备的实验研究 目的建立并评估大鼠心肌梗死后慢性心力衰竭(chronic heart failure)模型,研究大鼠CHF模型的超声心动图和心电图特点及血流动力学变化,为后期骨髓间充质干细胞移植治疗CHF的实验研究做好准备。 方法采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,使用小型呼吸机辅助呼吸,经胸骨正中切口开胸,尽量保持胸膜腔完整,充分暴露心脏,缝扎左前降支动脉根部,使左心室壁发生大面积梗死。8周后统计大鼠死亡原因,检测心电图、超声心动图和血流动力学指标的变化及其心肌梗死区域大小,并与假手术组(只开胸,不结扎冠状动脉)及对照组(既不开胸也不结扎冠状动脉)比较。 结果 1)模型组30只大鼠术中死亡7只,主要死亡原因为出血和心律失常;剩余的23只术后8周内死亡4只,主要为急性心力衰竭。8周内围手术期死亡率是36.67%。假手术组死亡1只,主要为术中大出血。 2)模型组术后急性期心电图示Ⅰ、aVL、Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST段持续抬高>0.2mV,24小时后Ⅰ、aVL导联形成永久性病理性Q波。对照组和假手术组无变化。 3)术前三组动物心脏超声心动图检查,各项指标均无差异,(P>0.05)。术后8周模型组与对照组及假手术组比较,左室前壁明显变薄,运动减弱或消失;左室间隔收缩期【(1.58±0.34 vs 2.16±0.16 vs 2.08±0.19)mm,P均<0.05】和舒张期厚度【(1.42±0.30 vs 1.89±0.21 vs1.81±0.24)mm,P均<0.05】及左室后壁收缩期【(2.05±0.39 vs 2.71±0.12 vs 2.60±0.16)mm,P均<0.05】及舒张期厚度【(1.84±0.34 vs 2.47±0.11 vs 2.33±0.11)mm,P均<0.05】明显变薄;左室收缩期【(5.22±1.07 vs 3.70±0.58 vs 3.81±0.44)mm,P均<0.01】和舒张末期内径【(7.05±1.03 vs 5.63±0.58 vs 5.68±0.45)mm,P均<0.01】明显增大;左室射血分数【(44.47±13.87 vs 80.00±3.86 vs 79.00±3.43)%,P均<0.01】和短轴缩短率【(19.47±7.66 vs 42.60±4.58 vs 41.67±3.57)%,P均<0.01】明显降低。对照组和假手术组上述指标差别不明显(P>0.05)。 4)术后8周,模型组与对照组及假手术组比较,血流动力学检查指标如左室收缩压【(123.42±13.20 vs 142.70±11.10 vs 146.11±14.74)mmHg,P<0.01】、左室最大压力上升变化率【(4760.16±634.25 vs 6674.20±628.57 vs 6622.88±542.04)mmHg/s,P<0.01】和左室最大压力下降变化率【(4543.89±628.14 vs 6439.40±612.67 vs 6381.44±539.38)mmHg/s,P<0.01】明显降低,左室舒张末压【(15.13±3.83 vs 3.40±0.81 vs 3.68±0.65)mmHg,P<0.01】明显升高。对照组和假手术组无明显差别(P>0.05)。 5)模型组术后8周,9只大鼠表现为心功能不全,LVEF在70~45%之间;10只大鼠呈现为CHF,LVEF<45%,占术后大鼠52.63%。所有CHF大鼠LVEDP均高于15mmHg。 6)病理组织学检查显示缺血部位心肌被纤维结缔组织替代,近心内膜处残留极少量心肌细胞,其余各层内不含有心肌细胞,缺血部位与周围非缺血部位的分界清晰。梗死面积为19-43.20%。 结论 1)前降支近段结扎可以造成大鼠前侧壁及下壁大面积心肌梗死,心肌梗死对心功能影响较大,术后8周可形成CHF模型。 2)心电图Ⅰ、aVL、Ⅱ、Ⅲ、aVF导联ST段在LAD结扎后持续抬高>0.2mV,可以作为大鼠大面积心肌梗死的早期判断指标,Ⅰ、aVL导联病理性Q波可作为陈旧性大面积心肌梗死的标志。 3)超声心动图检查可见模型组大鼠左室增大,室壁变薄,EF值降低等心力衰竭表现,术后8周EF值<45%可作为CHF形成的超声指标,这对研究CHF的实验研究具有重要意义。 论文3 同种异体骨髓单个核细胞移植治疗大鼠慢性心力衰竭的实验研究 目的探讨骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)移植对慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)大鼠心脏结构和功能的影响及其作用机制。 方法采用成年近交系雄性Wistar大鼠,建立CHF模型30只,并随机分成3组:空白对照组(组A,n=10),培养液注射组(组B,n=10)和细胞移植组(组C,n=10)。造模后通过心肌直接注射的方法,于细胞移植组移植DAPI标记过的同一近交系大鼠的BMMNCs;培养液注射组注射同等剂量的细胞培养液;空白对照组组仅开胸和关胸。细胞移植术前及术后8周对所有大鼠行超声心动图检查,测定左室射血分数、左室短轴缩短率和左室间隔及前后的壁厚度以评估心脏功能和结构;大鼠处死前行血流动力学检查,测定左室收缩压和左室舒张末期压及左室收缩和舒张最大压力变化率,以明确血流动力学的变化。最后处死大鼠,荧光显微镜下观察DAPI标记的细胞,HE染色组织学检查分析梗死区域毛细血管密度,非心梗区域心肌细胞行细胞调亡TUNEL分析。 结果 1)骨髓单个核细胞DAPI标记率为100%,DAPI标记的BMMNCs体外培养能够成活并成功传代。 2)三组CHF大鼠心脏超声结果在BMMNCs移植术前无明显区别(P>0.05)。术后8周,与空白对照组和培养液注射组比较,细胞移植组左室射血分数(45.90±8.05 vs 32.43±4.35 vs 32.11±4.26)和左室短轴缩短率(17.40±4.31 vs12.84±4.56 vs 12.97±4.37)明显增加(P<0.05),左室间隔收缩末期【(1.67±0.24 vs 1.39±0.17 vs 1.38±0.12)mm,P均<0.05】和舒张期末厚度【(1.53±0.21 vs 1.32±0.13 vs 1.32±0.10)mm,P均<0.05】及左室后壁收缩末期【(1.84±0.21 vs 1.59±0.20 vs 1.54±0.16)mm,P均<0.05】和舒张末期厚度【(1.66±0.16 vs 1.46±0.16 vs 1.43±0.12)mm,P均<0.05】也明显增加,左室内径收缩末期【(5.95±0.86 vs 7.48±1.28 vs 7.48±1.14)mm,P均<0.05】和舒张末期【(7.19±0.85 vs 8.53±1.12 vs 8.55±0.96)mm,P均<0.05】明显变小(P均<0.05);空白对照组和培养液注射组上述指标比较无明显区别(P>0.05)。 3)术后8周,与空白对照组和培养液注射组比较,细胞移植组血流动力学检查指标如左室收缩压【(141.80±16.63 vs 122.13±12.56 vs 124.00±12.93)mmHg,P<0.05】、左室最大压力升高变化率【(5362.00±807.99 vs4406.25±432.47 vs 4532.22±411.76)mmHg/s,P<0.05】和左室最大压力下降变化率【(4897.00±823.81 vs 4406.25±432.47 vs 4135.56±351.32,P<0.05)mmHg/s,P<0.05】明显升高,左室舒张末压【(10.89±2.62 vs 18.22±2.47 vs 17.16±2.49)mmHg,P<0.01】明显降低。空白对照组和培养液注射组上述指标比较无明显区别(P>0.05)。 4)细胞移植组心脏标本切片中未发现任何细胞核发DAPI标记的蓝色荧光。 5)术后8周病理检查显示:心梗区域毛细血管密度在空白对照组、培养液注射组及细胞移植组分别为【(2.14±0.62) vs (2.37±0.74) vs (7.08±1.06)】个/高倍视野,细胞移植组明显高于空白对照组和培养液注射组(P均<0.01);空白对照组和培养液注射组比较无明显区别(P>0.05)。 6)术后8周梗死区周边的心肌细胞凋亡率在细胞移植组、空白对照组及培养液注射组分别为:(2.61±1.134 vs 72±1.13 vs 4.54±1.21,P<0.01)。细胞移植组明显低于空白对照组和培养液注射组(P均<0.01);空白对照组和培养液注射组比较无明显区别(P=0.94)。 结论 1) BMMNCs移植可以明显改善CHF大鼠的心脏功能,减少心室重构;而心肌微量注射对心脏功能和结构影响不大。 2)荧光显微镜检查结果显示心脏标本切片中未发现DAPI标记的细胞,提示本研究中大鼠心功能的改善可能与BMMNCs横向分化的关系不大。 3) BMMNCs移植能够增加CHF大鼠梗死区局部的毛细血管密度,减少非梗死区心肌细胞的调亡,这可能是BMMNCs改善心功能的重要因素。 论文4 自体骨髓单个核细胞冠状动脉内移植治疗缺血性心力衰竭的临床研究 目的研究自体骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)经冠状动脉内移植治疗慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的可行性及其对心功能和心肌微小损伤的影响,探讨BMMNCs治疗CHF的机制。 方法本研究入选30例缺血性CHF患者,分为细胞移植治疗组和常规治疗组各15例,两组患者在药物治疗基础上,分别在介入治疗后,经Over-the-Wire(OTW)球囊导管于梗死相关动脉内支架远端注人自体BMMNCs悬液(细胞移植组)或等量的肝素生理盐水(常规治疗组)。介入术前和术后6个月分别对两组患者测定血清心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI),并行超声心动图检查,测定左室舒张末内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)和左室E峰和A峰比值(E/A比值)等指标。 结果 1)两组患者术前冠心病危险因素、冠状动脉病变程度和NHYA心功能分级等无明显区别;术后常规治疗组和细胞移植组其他治疗措施无明显差别;两组术中及术后无心肌缺血及恶性心律失常发生,细胞移植组全部病例采髓及移植成功,移植单个核细胞数目为(9.25±1.18)×10~7MBMC。 2)术后半年,与对照组比较,细胞移植组心力衰竭症状明显好转,NYHA分级(2.47±0.64 vs 3.23±0.70,P<0.01)明显改善;LVEF(40.20±5.19 vs 33.53±4.81,P<0.01)和E/A比值(0.96±0.10 vs 0.87±0.07,P<0.01)增加,左室内径【(65.22±8.28 vs 71.43±8.21)mm,P<0.05】明显减小;与术前比较,细胞移植组心力衰竭症状改善,NHYA分级明显降低(2.47±0.64 vs 3.67±0.49,P<0.01),LVEF(40.20±5.19 vs 32.13±4.52,P<0.01)和E/A比值(0.96±0.10 vs 0.89±0.09,P<0.01)增加,LVEDD【(65.22±8.28 vs 69.01±8.62)mm,P<0.05】明显减小;对照组上述指标手术前后差异不显著。 3)术后半年,血清cTnI与术前比较明显降低【(0.071±0.050 vs 0.037±0.038)ng/ml,P<0.05】,也明显低于同期对照组【(0.074±0.032 vs 0.037±0.038)ng/ml,P<0.05】;对照组血清cTnI水平手术前后差异不显著。 结论经冠脉自体BMMNCs移植可明显降低血清cTnI水平,同时改善心脏功能,减少心肌微小损伤可能是BMMNCs治疗CHF的机制之一,BMMNCs移植有望成为心肌梗死后CHF患者的一种新的治疗方法和思路。 本研究的创新性和局限性 一创新之处 一本研究联合采用多种检查技术,研究BMMNCs移植对CHF大鼠的心脏结构和功能、梗死区的毛细血管密度及非梗死区心肌细胞的调亡的影响。首次提出了减少非梗死区心肌细胞凋亡可能是BMMNCs移植改善CHF心功能的重要原因。 二我们发现心肌微小损伤在CHF自发进展中的重要价值,本研究在此基础之上探讨BMMNCs移植对CHF心肌微小损伤的影响,首次发现经皮冠状动脉内注入BMMNCs可减少CHF的心肌微小损伤。


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