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利用不对称体细胞杂交技术构建普通小麦辐射杂种嵌板及其图谱的研究

周传恩  
【摘要】: 不对称体细胞杂交利用原生质体融合技术,可以将供体遗传物质跨越生殖隔离,转移到受体中并创造杂种。目前已经获得了许多种内/间,属/族间,甚至科间的体细胞杂种。基于体细胞杂交技术的全基因组辐射杂种图谱在哺乳动物基因定位和基因组分析中起到了关键作用,这项技术根据分子标记在杂种细胞中的“有”或“无”就可直接对标记位点进行排序,并且它所能达到的分辨率也是其他作图方法很难做到的。迄今为止,已构建了许多模式动物,如人、大鼠、小鼠、马等的全基因组辐射杂种图谱。但是关于植物的辐射杂种嵌板和图谱近年来才有研究,利用该技术对拥有大基因组的植物的作图(包括普通小麦)目前已经引起国际上的关注。 本研究通过柴胡×普通小麦的体细胞杂交实验,研究了不对称体细胞杂种细胞系用于构建小麦辐射杂种嵌板及其图谱的可行性,对比了紫外线和γ射线对不对称体细胞杂种遗传组成的影响。在此基础上,我们构建了两个含有不同细胞群体的小麦全基因组辐射杂种嵌板。通过计算嵌板中分子标记的保留情况,我们得到了小麦5A染色体的辐射杂种图谱,定位了三个小麦5A unigene的EST并对前人利用缺失系定位在5A单个bin中的25个小麦EST进行了排序,以研究体外拯救用于构建小麦全基因组辐射杂种嵌板和图谱以及进行基因定位的可行性。 1.利用不对称体细胞杂交技术构建小麦辐射杂种嵌板及其图谱的可行性 最初,我们希望利用紫外线处理,将柴胡的药效基因通过染色体片段的插入或易位转入小麦进行育种研究。因此,我们将柴胡原生质体用紫外线照射后与小麦原生质体进行融合。但是在获得的杂种中,柴胡的染色体没有被片段化并渐渗到小麦基因组中。相反,分子标记和原位杂交分析表明:小麦染色体/DNA片段被整合到柴胡基因组中。经过一年的体外培养,渐渗到柴胡基因组的小麦特异SSR位点在不对称杂种中仍然被稳定保留,其平均分子标记保留率为20.5%。虽然得到的结果与预期相反,但这为我们提供了一个构建小麦辐射杂种嵌板及图谱的机会。这是第一个利用紫外线而不是χ射线或γ射线诱导的小麦全基因组辐射杂种嵌板。我们推测:若柴胡与经射线处理的小麦进行融合,得到的不对称体细胞杂种将更适于进行小麦辐射杂种嵌板和图谱的构建,值得进一步研究。 2.紫外线和γ射线在构建小麦辐射杂种嵌板过程中对小麦染色质渐渗的影响 为了对比紫外线和γ射线在不对称体细胞杂交中对小麦染色质渐渗的影响,我们设计了由这两种射线诱导的柴胡×小麦7个不对称融合组合和作为对照的对称融合组合。7个不对称组合共获得155个杂种,对称融合共获得8个杂种,这些杂种的平均分化频率为20%。基因组原位杂交分析表明,小麦染色体/DNA片段随机渐渗到柴胡的基因组中。从8个不同融合组合中分别随机挑选出8个杂种克隆,总共选出64个杂种克隆,组成的8个杂种细胞系群代表了8个不同的融合组合,它们连同两个亲本被用于遗传多样性分析。利用分子标记技术,分析了124条RAPD谱带/单个杂种,126条ISSR谱带/单个杂种和42个小麦特异的SSR位点/单个杂种。基于RAPD和ISSR分析得到的遗传相似性系数矩阵,分别构建了8个融合组合连同亲本的非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类图。结果表明:除了WB3K,其他不对称融合组合根据射线类型的不同被分为差异明显的两个大组,进一步结合SSR分析得出的小麦DNA在每个杂种组合中的保留率表明:射线类型和辐射剂量不会对杂种的分化频率及分化程度产生影响;双亲间亲缘关系的远近与射线处理都会对辐射杂种基因组的不对称程度产生影响,但这两个影响因素并非是各自独立的并且它们的效应也不是简单叠加的,而是一个复杂的相互作用的过程。通过本研究我们比较了紫外线和γ射线之间的生物学剂量对应关系,结果表明:在远缘不对称体细胞杂交中(如科间),一定剂量范围的紫外线与低剂量的γ射线(3Krad)处理效果相似;而比高剂量的γ射线(5Krad,7Krad)诱导供体染色质渐渗到受体基因组的效率高。因此,紫外线更适宜用于构建小麦辐射杂种嵌板。 3.柴胡×普通小麦不对称融合体系的特点 由于亲本细胞的长期继代培养,单独培养的小麦原生质体只能再生小细胞团,单独培养的柴胡原生质体只能分化出绿点而不能得到植株,这说明杂种植株的再生是双亲基因组发生互补的结果。因此再生植株的细胞克隆可以被初步确认为杂种。利用这一特点以及杂种细胞优先生长的特性对杂种进行初步筛选,一方面可以降低杂种筛选的工作量,另一方面也可以避免利用选择标记进行筛选导致供体染色体片段保留的非随机性。 柴胡基因组在组织培养过程中表现出相当强的稳定性,经过长达12年的体外培养后,仍有90%以上的柴胡细胞拥有完整的染色体组(2n=12)。小麦染色质渐渗到柴胡基因组后,经过两次相隔一年的小麦特异SSR位点检测,结果表明这些位点在柴胡中仍然存在并稳定遗传。因此,柴胡基因组的这一特性使其能够作为一个稳定的受体用于小麦染色体片段的体外拯救,进而构建小麦辐射杂种嵌板。另一方面,小麦与柴胡分属不同的科,它们之间的亲缘关系非常远,所以我们利用小麦与柴胡基因组间的这种巨大差别就能够根据分子标记的多态性,甚至只是“有”和“无”的差异进行辐射杂种图谱的构建。 4.构建小麦全基因组辐射杂种嵌板 在本实验中,分别构建了由92个杂种克隆组成的小麦全基因组辐射杂种嵌板Ⅰ和184个杂种克隆组成的小麦全基因组辐射杂种嵌板Ⅱ。利用68个小麦5A染色体的SSR位点分析了两个嵌板中小麦遗传物质的保留情况。结果表明,辐射杂种嵌板Ⅰ的小麦5A染色体平均供体DNA保留率为33.59%,所有杂种中都至少保留有一个SSR位点。辐射杂种嵌板Ⅱ的小麦5A染色体平均供体DNA保留率为33.98%,在184个辐射杂种中,有10个没有保留任何用于检测的SSR位点。利用CarthaGene中的mapocb命令计算得知,嵌板Ⅰ中共有1557个染色体断裂点,嵌板Ⅱ中共有2034个染色体断裂点。因为小麦5A染色体的大小约为781Mb,所以这两个辐射杂种嵌板的分辨率分别为501.6Kb和383.9Kb。 5.构建小麦5A染色体辐射杂种图谱并定位小麦unigene的EST 基于分辨率相对较高的辐射杂种嵌板Ⅱ(383.9Kb)的SSR数据,利用CarthaGene软件构建了小麦5A染色体的辐射杂种图谱。该综合图谱包含了68个SSR位点,长度为2103cR。根据小麦5A染色体的长度(781Mb)可知,该小麦辐射杂种图谱的1cR约等于371Kb。由于嵌板包含的辐射杂种数目和作图所用的标记数目对图谱分辨率都会产生影响,因此如果将该图谱中分子标记数目增加到378个,那么我们推算利用柴胡×小麦辐射杂种体系得到的辐射杂种图谱的分辨率理论上将达到89Kb。随后我们利用这个图谱定位了三个小麦unigene的EST,其中BQ172091和CA616563共保留频率较高,它们与Xwmc524连锁紧密,距离为13.7cR;A603697与Xbarc92连锁紧密,距离为15.2cR。以上结果表明,采用体外拯救的方法,通过对小麦基因组进行适宜剂量的辐射处理,可以使小麦染色质充分片段化,从而增加其在柴胡基因组中的保留模式,提高作图分辨率。 6.对bin C-5AL10-0.57~*中的25个EST位点进行排序 Bin C-5AL10-0.57~*位于小麦5A染色体的着丝粒区域,并覆盖了5A染色体长臂的部分区域。利用辐射杂种嵌板Ⅰ对小麦5A染色体bin C-5AL10-0.57~*中的25个EST位点进行了排序。经过CarthaGene软件计算,这25个EST被分为2个连锁群和15个单独的EST。第一个连锁群包括:BE591152,BE423288,BE442763,BE403443,BE446342,BE423213,BE443745,BE637989;第二个连锁群包括BE443755和BF202930。由build命令构建得到了25个EST位点的辐射杂种图谱,其长度为2700.5cR。结果表明在不对称体细胞杂种中,辐射处理可引起染色体任何区域的断裂。即使是在小麦缺失系中缺少断裂点的着丝粒区域,利用辐射杂种技术也可以对单个bin中的分子标记进行排序。


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