中国汉族人RhD阴性表型的分子机理研究

【摘要】： Rh血型系统是人类血型中最具多态性和免疫遗传特性的一个系统，迄今已发现含有49个独立的抗原，是输血医学中除ABO血型之外最具临床意义的一个血型系统。RhD抗原的高免疫原性常常会引起胎儿和新生儿溶血病(HDFN)、溶血性输血反应和自身免疫性溶血性贫血等疾病。自上世纪90年代编码2个Rh蛋白的基因RHD和RHCE被克隆以来，人们对Rh血型系统的分子机理已获得相当多的认识。近年来对RhD抗原和RHD基因的免疫学及分子生物学研究已成为国际上的热点并取得重要进展。2000年，研究人员发现RHD基因两侧各有一段Rh盒子(Rhesus boxes)基因，其序列的高度同源性引发了RHD基因的缺失并形成融合基因，这是人类第一次构思和阐明RhD阴性表型形成的分子机制。对RhD抗原和众多D变种(迄今已发现40种弱D型和25种部分D型)的研究表明RhD的血清学表型存在复杂的分子机制，包括单核苷酸多态性(SNPs)、基因缺失和插入、基因互换和重组、基因转换等。在Rh血型分子机制逐渐阐明之后，以PCR为基础的分子生物学分析已应用于临床，其中RHD基因定型和在孕妇血浆中检测胎儿RHD基因等技术最具临床价值。另外，分析孕妇丈夫RHD基因的纯合性可预测胎儿患HDFN的几率，应用基因定型可解决献血者的疑难血型鉴定、反复大量输血或近期输血病人的血型鉴定、D变种(弱D、部分D型)的鉴定等血型血清学中的疑难问题。 然而对RHD基因的研究显示其存在明显的种族差异，以高加索人基因结构为基础的基因定型等临床应用在其他民族中存在局限性。在非洲人RhD阴性个体中普遍存在RHDΨ基因和RHD-CE-D~s基因，从而造成RHD基因定型的假阳性。亚洲人中存在一种称为Del型的弱D型个体，该型在日本人或中国人RhD阴性个体中所占比例为10-33％。Del型个体存在几乎完整的RHD基因，其弱D抗原只能通过繁琐耗时的吸收放散实验才可检测出来。另外在亚洲人RhD阴性个体中还存在一定比例的RHD-CE-D杂化基因及少量基因突变。对亚洲人(包括中国人)RHD基因的研究远滞后于对高加索人的研究，关于Del型的分子机制和免疫机制、D-CE-D杂化基因、弱D型和部分D型、Rh盒子基因序列等分子机理仍未清楚，因而无法准确可靠地将基因定型技术应用于临床。 本研究在以往研究的基础上，运用实时荧光定量PCR、多重PCR、PCR-RFLP、DNA序列分析等先进技术对中国汉族人RhD阴性RHD基因结构进行系统性的分子生物学分析和研究，以建立中国人RHD基因结构的数据库并将以此为基础将分子生物学技术应用于新生儿溶血病产前诊断、疑难血型的基因定型等临床医学中。 【目的】 研究和分析中国汉族人RhD阴性表型个体、RhD阳性表型个体和部分D表型的RHD及Rh盒子基因的结构，以阐明中国汉族人群RhD阴性表型形成的分子机理，并对Rh盒子基因的扩增产物进行分析以确定RHD基因的纯合性，建立中国人RHD基因结构的数据库并以此为基础将基因定型技术应用于临床医学中。 【方法】 1．首先对大量献血者样本采用标准血清学方法进行RhD抗原鉴定。对所有RhD抗原初筛阴性样本，采用间接抗人球蛋白方法和吸收放散试验进一步检测D抗原，以排除或确认弱D型、Del型或部分D表型。对RhD阴性样本进行RhCcEe表型的血清学和分子生物学分型。 2．选择176例RhD阴性标本、11例RhD阳性标本和8例部分D标本，采用3种进口DNA提取试剂盒，提取其基因组DNA。所选择样本均系中国汉族人，无亲缘关系。 3．对65例RhD阴性标本和11例RhD阳性标本，采用实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR，RQ-PCR)技术检测其RHD基因第7外显子。 4．采用多重PCR(Multiplex PCR-sequence specific primer，MPX-PCR)技术检测所有176例样本RHD基因第3，4，5，6，7和9外显子，扩增产物以12％的聚丙烯酰胺凝胶检测。 5．根据RHD基因的内含子序列设计RHD基因的特异性测序引物，对部分样本进行RHD基因外显子特异性PCR-SSP分析。对RHD基因第6和10外显子，采用高保真(Expand high fidelity)PCR扩增体系。 6．采用高保真PCR扩增体系，扩增部分样本的Rh盒子基因的特异性序列并进行测序分析。 7．对所有176例样本采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Restrict fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技术进行RHD基因的纯合性测定。 8．采用根据RHD基因的内含子序列设计的RHD基因特异性测序引物，对部分样本的RHD基因10个外显子进行扩增，扩增产物进行测序分析。 【结果】 1．对176例RhD阴性样本的分析表明，114例(65％)样本在多重PCR-SSP分析中显示缺失RHD基因，在PCR-RFLP分析中显示为纯合的RHD基因阴性。 2．49例(28％)样本在血清学吸收放散试验中显示为Del表型。其MPX-PCR分析显示均存在RHD基因6个外显子，PCR-RFLP分析显示其中43例为杂合的RHD基因，6例为纯合的RHD基因。对该组中22例样本的测序分析显示均存在一个RHD基因第9外显子第1227位G＞A的突变，该突变是Del表型所特有的。 3．12例(6％)样本MPX-PCR显示缺失RHD基因，但PCR-RFLP分析显示存在1个RHD基因，进一步的测序PCR分析表明它们至少存在RHD基因第1和10外显子。 4．1例(1％)样本MPX-PCR分析显示存在RHD基因，但缺失第6外显子。对其RHD基因全部10个外显子的测序分析表明，该样本存在一个新的933位C＞A的突变。 5．对27例在多重PCR分析中显示缺失RHD基因和在RFLP分析中为RHD基因阴性纯合样本的杂化Rh盒子基因进行DNA测序分析，表明中国汉族人存在与高加索人相一致的杂化Rh盒子基因序列。 6．对8例部分D表型样本的分子生物学分析表明，存在RHD基因的第1、7、8、9、10，缺失第3、4、5和6外显子，其基因结构与部分D~ⅥtypeⅢ型相近。 【结论】 1．RHD基因缺失，RHD基因第1227位G＞A Del型突变，RHD-CE-D杂化基因和一个新的933位C＞A的突变是研究样本中导致形成RhD阴性表型的四种分子机制。RHD基因缺失是引起中国汉族人RhD阴性表型形成的主要分子机理。 2．RHD基因第1227位G＞A Del型突变是引起基因定型和血清学定型结果不一致的主要原因。 3．中国汉族人RhD阴性个体存在与高加索人相一致的杂化Rh盒子基因序列。RHD基因缺失发生于与高加索人相一致的断点区域。 4．中国汉族人部分D表型存在特殊的基因结构，其献血者应作为RhD阳性。