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肿瘤相关基因cDNA芯片的制备及在肺癌研究中的应用

傅忠燕  
【摘要】: 肿瘤相关基因cDNA芯片的制备及在肺癌研究中的应用 肺癌为最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年大约有100万人死于肺癌,占肿瘤死亡率的1/6,居各种肿瘤之首。肺癌的发生是一个多阶段的过程,与多种原癌基因的激活和抑癌基因的失活有关,这一过程是逐渐积累的。cDNA微阵列技术可同时监测成千上万个基因的表达状况,并能达到高敏感地定性、定量检测基因表达水平变化的目的。本实验利用自行设计制备的肿瘤相关基因cDNA芯片,进行了肺癌发生、转移及中药单体大黄素诱导肺癌细胞凋亡的分子机理的探讨,旨在较全面了解影响肺癌发生的基因及其调控机制,为指导诊断与治疗提供重要的线索。 1 cDNA芯片的制备 我们根据已有的研究结果,查找了与肿瘤的发生发展密切相关的基因,根据基因名称和NCBI提供的Genbank的基因序列号,自Research Genetics公司购买了447个肿瘤相关基因克隆,自Geneservice公司购买了1208个肿瘤相关基因克隆,构建了肿瘤相关基因cDNA克隆库。利用这个克隆库作为制备芯片的靶基因,提取靶基因的质粒、以载体特异性的引物扩增靶基因,对提取的质粒和PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。纯化PCR产物,重悬纯化产物,Pixsys 5500自动点样仪接触式点样。点样后的玻片通过一系列处理,使靶基因牢固的固定于玻片表面,并阻断非特异性结合位点,提高杂交效率。选取制备的第一张和最后一张芯片进行杂交实验,对芯片质量进行检验。测序结果显示所购克隆为目的基因克隆,电泳结果显示提取的质粒和PCR产物保持了较好的纯度和均一性。芯片杂交结果显示芯片的背景低,杂交点清晰,杂交点均匀而圆滑。提示本批次芯片在制备的各个环节均达到了质量要求,可以应用于相关研究。 2 cDNA芯片在肺癌组织基因表达谱研究中的应用 取术前未接受化疗和放疗肺癌病人的新鲜肺肿瘤组织及相应正常肺组织18例,Trizol提取标本RNA,逆转录,间接法以荧光染料Cy3或Cy5标记探针,42℃水浴杂交18-20小时,Scanarray4000扫描芯片,Quantarray3.0分析结果。结果在5例以上患者中出现共同性表达上调的基因35个,在5例以上患者中出现共同性表达下调的基因17个。对这些基因按照功能进行了归类,包括运输载体、代谢相关基因、细胞信号转导分子、细胞骨架、转录调控因子以及未知功能基因。选择在肺癌组织中高表达的基因CD24和Keratin14进行半定量RT-PCR对芯片所得结果进行验证。RT-PCR结果与芯片所得结果基本一致。肺癌基因表达谱的差异隐含了肺癌在发生发展过程中的分子基础。本研究应用肿瘤相关基因芯片筛查了肺癌组织中表达变化的肿瘤相关基因,将有助于寻找理想的肺癌筛查标志物,为临床肺癌诊断和治疗提供理论参考。 3不同转移潜能人肺癌细胞系基因表达谱的研究 人巨细胞肺癌高转移细胞系95-D和低转移细胞系95-C来源于同一母细胞PLA-801。Transwell小室法测定95-D和95-C细胞的体外转移潜能,应用cDNA芯片分析95-D和95-C细胞的基因表达谱,选取差异表达基因进行半定量RT-PCR验证。结果显示95-D细胞的体外侵袭能力显著高于95-C细胞。与95-C细胞比较,在95-D细胞中有47条基因高表达,22条基因低表达。这些基因按照功能可以分为运输载体、代谢相关基因、细胞信号转导分子、细胞骨架、转录调控因子以及未知功能基因。RT-PCR结果与芯片结果基本一致。筛选所得基因可能与肺癌的侵袭相关,对这些基因的进一步研究将有助于对肺癌侵袭、转移分子机理的理解。 4大黄素对小细胞肺癌细胞系NCI-H446基因表达谱的影响 肺癌根据细胞分化程度和形态特征划分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。小细胞肺癌恶性程度较高,细胞生长快,侵袭力强,远处转移早,对小细胞肺癌的治疗主要是放疗和化学治疗。大黄素具有抗肿瘤的作用,但对于小细胞肺癌的影响未见报道。本研究探讨大黄素对于小细胞肺癌细胞生长、凋亡以及基因表达的影响。以20μmol/L大黄素处理NCI-H446细胞不同时间,MTT法检测大黄素对于细胞活性的影响,以流式细胞术和caspase-3活性检测大黄素对于细胞凋亡的影响。cDNA芯片技术分析大黄素处理后细胞基因表达谱的变化。半定量RT-PCR验证芯片结果。结果显示大黄素对于细胞活性的抑制和细胞凋亡的诱导具有时间依赖性,同时大黄素还引起了NCI-H446细胞细胞周期的改变。大黄素处理12小时后,在1262个肿瘤相关基因中,10个基因上调2倍以上,8个基因下调2倍以上;而在处理24小时后,12个基因上调2倍以上,24个基因下调2倍以上。这些基因的功能分别与细胞代谢,信号转导,转录调控,细胞骨架组织,免疫反应,细胞运输,蛋白合成,细胞周期调控,细胞黏附以及RNA处理有关。RT-PCR结果与芯片结果一致。受大黄素调控发生变化的基因具有不同的细胞功能,且在细胞凋亡,肿瘤转移,化疗耐药中发挥重要作用,这些结果显示大黄素有可能成为小细胞肺癌化学预防和化学治疗的有效药物。


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