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茶藨子木层孔菌多糖及其硫酸化衍生物的制备、结构分析与生物活性研究

刘玉红  
【摘要】: 茶藨子木层孔菌(Phellinus ribis)为锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)木层孔菌属(Phellinus)真菌,寄生于山楂、梨树的活体根茎上,民间用于防治肝炎、增强免疫力,疗效确切。木层孔菌属中很多真菌是药用资源,如松木层孔菌(Phellinuspini)、裂褐层孔菌(Phellinus rimosus),作为中药桑黄来源的针层孔菌(Phellinusigniarius)、裂蹄针层孔菌(Phellinus linteus)、鲍氏木层孔菌(Phellinus baumii)等。近年来研究发现,这些药用木层孔菌多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等作用,而关于茶藨子木层孔菌的药效学物质基础成分的研究尚未见报道。我们首次从茶藨子木层孔菌中分离得到一种具有免疫调节活性的多糖组分PRP,对其理化性质进行了分析,利用化学分析和波谱技术对其结构进行鉴定,结果表明PRP为一种结构新颖的葡聚糖。本论文还对PRP进行了硫酸化结构修饰,并对PRP及其硫酸化衍生物的体外抗肿瘤活性、免疫作用等生物活性进行了研究。研究内容与结果如下: (1)优化茶藨子木层孔菌总多糖(TPRP)的提取工艺。采用正交实验确定最佳提取工艺为15倍量水,90℃提取4h,共提取3次。酶法与Sevag法合用去蛋白,乙醇分级沉淀获得分级多糖(FPRP),蒽酮-硫酸法测得多糖含量为87.08%,Folin-酚法测得蛋白质含量为7.83%。 (2)茶藨子木层孔菌多糖(PRP)的分离纯化。FPRP经DEAE-纤维素离子交换和Superdex凝胶过滤柱层析分离纯化得多糖纯品PRP。高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定表明PRP为均一多糖组分。HPGPC测得其重均分子质量((?)_w)为8.59 kDa;PRP的比旋度为+16.8°(c 0.1,H_2O),比旋度值较低提示PRP可能含有较多的β-糖苷键;总糖含量为97.3%,蛋白质含量为1.03%。PRP与苯酚-硫酸及蒽酮-硫酸反应呈阳性,与咔唑-硫酸、茚三酮、碘-碘化钾及三氯化铁反应呈阴性。 (3)PRP的结构分析。经水解、糖腈乙酸酯衍生化、薄层层析(TLC)及气相色谱(GC)分析表明,PRP仅由葡萄糖组成。高碘酸氧化结果表明PRP中含有1→6糖苷键,还应含有1→2或1→4糖苷键。Smith降解结果表明PRP中1→6糖苷键(包括末端糖基)、1→4糖苷键和1→3糖苷键的摩尔比为5.0:3.0:1.0。PRP经甲基化、水解和乙酰化得到部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物,气相色谱—质谱(GC-MS)分析表明该衍生物依次由1,5-二-O-乙酰基-2,3,4,6-四-O-甲基-葡萄糖(末端葡萄糖)、1,4,5-三-O-乙酰基-2,3,6-三-O-甲基-葡萄糖(1→4连接的葡萄糖)、1,5,6-三-O-乙酰基-2,3,4-三-O-甲基-葡萄糖(1→6连接的葡萄糖)和1,3,5,6-四-O-乙酰基-2,4-二-O-甲基-葡萄糖(1→3,6连接的葡萄糖),组分摩尔比约为1.0:3.0:4.0:1.0。紫外(UV)结果表明PRP基本不含蛋白质和核酸。红外光谱(IR)表明PRP具有多糖的特征吸收峰,且提示PRP由β-D-吡喃葡萄糖组成。部分酸水解表明PRP的主链由(1→4)、(1→6)-连接的糖苷键组成。核磁共振波谱(~1H NMR及~(13)C NMR)数据表明PRP的重复单元含三种糖苷键的连接方式,且糖残基均为β-构型;结合~1H,~1H COSY和~1H,~(13)C HMQC谱对PRP的大部分C、H化学位移进行了归属。综合上述分析,推测PRP的重复单元可能的结构如下: (4)PRP的体外抗肿瘤和免疫活性研究。MTT法测定PRP体外对肿瘤细胞的影响,结果表明PRP对人肝癌细胞株Bel-7402、肝癌细胞株HepG2、乳腺癌MDA231没有直接的杀伤作用。体外免疫实验表明,PRP可显著促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,在浓度20μg/mL时作用最强,增殖指数达1.266,高于或低于此浓度,促进作用减弱,呈钟罩形的剂量-效应曲线,说明PRP具有免疫促进作用。PRP与2μg/mL的ConA合用,在低浓度(5μg/mL、10μg/mL)时对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用大于单独使用2μg/mL的ConA,而在高浓度(50μg/mL、100g/mL)时合用与单独应用ConA对脾淋巴细胞增殖的作用无显著性差别。说明低浓度的PRP(5μg/mL、10μg/mL)可协同2μg/mL的ConA促进对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。 (5)PRP的硫酸化和结构分析。通过改变氯磺酸的比例,制备得到了不同硫酸化程度的PRP(PRP-SⅠ、PRP-SⅡ、PRP-SⅢ和PRP-SⅣ),(?)_w分别为14.61、20.54、22.43和21.42 kDa,比旋度分别为+9.87°、+2.63°、-3.42°、-2.46°(c 0.1,H_2O)。玫瑰酸钠法测定PRP-SⅠ、PRP-SⅡ、PRP-SⅢ和PRP-SⅣ的硫酸根含量分别是28.87%,51.52%,60.41%,56.03%。IR图谱显示硫酸化衍生物在1258 cm~(-1)和810 cm~(-1)处有S=O的伸缩振动峰和C-O-S的伸缩振动峰,从PRP-SⅠ到PRP-SⅢ,峰强依次增大,硫酸化程度依次增高。~(13)C NMR结果表明从PRP-SⅠ到PRP-SⅢ,硫酸化程度依次提高,硫酸化位置首先发生在侧链葡萄糖残基和(1→4)-葡萄糖残基的C6-OH上,随着硫酸化程度的提高,其它位置的羟基也会被取代。 (6)PRP及其硫酸化衍生物的生物活性研究。MTT法检测PRP及其硫酸化衍生物体外对肿瘤细胞的影响,结果表明随着硫酸化程度的提高,PRP硫酸化衍生物对HepG2细胞的抑制作用呈增加的趋势。PRP及硫酸化衍生物均可以促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,在实验浓度范围内,PRP-SI呈现一定的剂量依赖性,在500μg/mL时,增殖指数最高为2.50;PRP、PRP-SⅡ、PRP-SⅢ和PRP-SⅣ有最适剂量,分别为20、250、100、100μg/mL。从总体趋势看,随着硫酸化程度的提高,PRP硫酸化衍生物对脾淋巴细胞的增殖作用呈增加的趋向。PRP对内皮细胞ECV304无明显的影响,而经硫酸化后具有较强的内皮细胞抑制作用。多糖PRP对斑马鱼体节间血管的生成具有较强的抑制作用,其硫酸化衍生物虽然也表现出一定的抑制活性,但未见提高。 本研究取得的创新性成果主要有: (1)首次从茶藨子木层孔菌中分离得到均一的多糖组分PRP,(?)_w为8.59kDa,比旋度为+16.8°(c 0.1,H_2O),总糖含量为97.3%,蛋白质含量为1.03%。 (2)确定了PRP的结构,主链由(1→4)-β-D-葡萄糖和(1→6)-β-D-葡萄糖组成,在(1→6)-β-D-葡萄糖的C3位有分枝,此结构未见报道。 (3)首次对多糖PRP进行了体外抗肿瘤和免疫活性研究,结果表明PRP无细胞毒活性而具有较强的免疫增强作用,另外斑马鱼血管生成模型实验表明PRP具有较强的抑制血管生成作用。 (4)首次对PRP进行了硫酸化结构修饰并进行了相关的生物活性研究,结果表明PRP经硫酸化后体外抗肿瘤、淋巴细胞增殖活性、内皮细胞抑制作用增强,对斑马鱼体节间血管的抑制作用降低。


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