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扫描电化学显微术构建酶微米结构

韩帅兵  
【摘要】: 第一章首先对扫描电化学显微镜(SECM)的试验装置,工作模式进行了简要的介绍。然后就SECM的应用在以下两个方面做了较详细的介绍:1.SECM在生物方面的应用,其中包括对酶,抗原/抗体,DNA及细胞的检测和成像;2.SECM在各种材料表面进行微修饰,尤其是生物材料微米图形的构建。本章共引用文献113篇。 第二章我们用葡萄糖氧化酶(GOx)修饰过的微米电极表征了辣根过氧化物酶(HRP),并将得到的结果与收集模式及反馈模式表征的结果进行了比较。我们首先用交联法将GOx固定在金圆盘微米电极的周围,在含有葡萄糖及氢醌(H_2Q)的溶液中用此电极表征了HRP的活性。由于葡萄糖与溶液中的O_2可以在电极上的GOx的催化下生成H_2O_2,H_2O_2与H_2Q即可在HRP的催化下生成苯醌(BQ),BQ在电极上可以被还原生成H_2Q,使探头扫描电流增大,从而表征了HRP的活性。由于用这种电极表征HRP时底物中的一种即H_2O_2是在电极上生成的,而不是一直存在于溶液中,所以用它表征所得的结果分辨率比收集模式好,而灵敏度较反馈模式要高。 第三章用凹形铂微米电极在铂基底电极上构建得到了GOx的微米点。在本章中我们首先将电聚合绝缘及电化学刻蚀相结合制得了凹形铂微米电极,然后又用电化学方法研究了GOx在铂电极上的电化学吸附特性,确定了GOx在铂电极上电化学吸附的最佳条件为:GOx浓度为10 mg/mL,溶液中含有0.8×10~(-3)mol/L的Triton X-100,电极电吸附电位1.3 V(vs.Ag/AgCl),恒电位时间60 min;最后将凹形铂电极应用到电吸附构建GOx的过程中,将其作为参比电极及辅助电极,将基底铂电极作为工作电极,通过GOx的电吸附构建得到了有活性的微米点,其直径在20μm左右,并用SEM及SECM进行了表征。 第四章我们用扫描电化学显微术“蘸笔法”构建了葡萄糖氧化酶(GOx)微米点。本章将原子力显微镜中的“蘸笔式”纳米刻饰技术(Dip-Pen nanolithography,DPN)技术的理念运用到SECM中。在工作中首先制作了双铂微米电极,根据上章选择的最佳条件将GOx电吸附富集到其中一根微米电极上。将电极逼近到铂基底电极上以后,其中一个铂微米电极作为参比和辅助电极,而吸附了GOx的电极作为工作电极,在其上施加一合适电位使GOx脱吸到溶液中,同时在基底铂电极上施加GOx最佳的吸附电位,通过吸附—脱吸—吸附的过程使GOx固定到基底铂电极上得到有活性的GOx微米点,并用SECM对其活性进行了表征,得到的微米点直径在20μm左右。另外,在构建GOx微米点时,为了减小GOx扩散所引起的微米点的扩大,我们还采用了在双铂微米电极和基底铂电极之间形成一个厚度在2-4μm,直径与双铂微米电极外径相同的液膜这一新技术。 第五章中我们在第四章的基础上将SECM“蘸笔法”构建生物物质微米点这一方法进行拓展,将其运用到HRP微米点的构建中。本章中我们首先研究了生物素化的HRP(Bio-HRP)在铂电极上的吸附及脱吸特性;在构建HRP微米点时,先根据Bio-HRP在铂电极上吸附的最佳条件,将Bio-HRP吸附到自制的微米铂电极上,然后将铂电极在合适电位下即-0.3 V(vs.Ag/AgCl)逼近到链霉亲和素化的基底上方10μm左右,再将Bio-HRP从电极上自然脱吸,通过生物素与亲和素的反应将其固定到基底上得到微米点,并用SECM对其活性进行了表征。同时在工作中我们也采用了与第四章相同的技术,即在UME与基底之间形成一厚度为10μm左右,直径与UME直径相同的液膜,以减小分子扩散对结果的影响。


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