通心络对自发性高血压大鼠心肌重构干预的实验研究

【摘要】： 背景 心肌重构是高血压病常见的靶器官损害,其病理改变主要包括两个方面:一是心肌细胞的增生与肥大,二是心肌细胞外基质重构。心肌重构不但使心室硬度增加,心脏功能减退,还可导致心肌缺血和心源性猝死,因而防止与逆转高血压心肌重构已是目前治疗高血压的重要目的之一。近年来,国内外学者在高血压心肌重构方面进行了一定的基础和临床研究,取得了阶段性成果,但高血压心肌重构的发生机制、早期诊断及治疗措施仍处在探索中。深入研究其发生机制,探讨对其的干预措施无疑对高血压心肌重构的诊治具有重要意义。 心肌细胞外基质重构是指在心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中胶原纤维过量积聚、胶原含量显著升高或胶原成分发生改变。ECM主要由纤维胶原网,基底膜,蛋白多糖和葡糖胺聚糖组成,其中胶原占85%,主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原。胶原的降解主要由基质金属蛋白酶(MMPs)调节,而MMPs降解胶原的活性受内源性金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)的影响,MMPs-TIMPs的平衡对维持胶原的正常代谢有重要作用。总之,高血压心肌重构的发生是由众多生物活性因子参与调节的复杂过程。因此,从心肌重构的发生机制来讲,调节生物活性因子的活性、抑制心肌成纤维细胞胶原的合成并促进其降解是预防与逆转心肌细胞外基质重构,改善心功能的关键环节。据报道,许多中药有抗心肌重构的作用。通心络胶囊作为国内新开发的一种复合中药制剂,以络病理论为指导,遴选益气、活血化瘀药和虫类通络药共同组方而成,近年发现通心络可通过降低血压等多种途径对心血管起保护作用。但通心络是否对心肌重构有预防或逆转作用尚未可知,因此我们提出假设,探讨通心络是否有降压以外的抗心肌重构作用及其可能的分子生物调控机制。 对该问题进行深入研究,可以为通心络扩大新的应用领域,为药物干预心肌重构,从而逆转心肌重构及由心肌重构向心力衰竭的转化提供新思路。 目的 1.观察通心络对自发性高血压大鼠心肌重构的干预作用。 2.探讨通心络在心肌细胞外基质重构中的分子调控机制。 方法 8周龄雄性SHR大鼠16只,随机分为阳性对照组即SHR组(n=8只)和通心络组(n=8只),同周龄Wistar京都(WKY)大鼠8只作正常对照组即WKY组(n=8只)。通心络组给予通心络1.5g.kg~(-1).d~(-1)灌胃12周,WKY组和SHR组等量生理盐水灌胃。实验过程中,进行以下检测:(1)每周测量体重1次,每两周检测尾动脉血压1次。(2)分别于实验开始前、实验末进行超声心动图检查。(3)于实验末以心导管法进行血流动力学测定。(4)处死动物后,称取左室重量(LVM),计算左室重量/体重比(LVM/BW)。(5)心肌组织超微结构和病理学检查。(6)应用Masson染色进行心肌组织间质胶原定量。(7)免疫组织化学检测P65及P50表达。(8)Western blot检测Phospho-IκBα,P65和P50蛋白表达。(9)实时定量RT-PCR法检测P65,PS0,MMP-9,TIMP-1,CollagenⅠ,CollagenⅢmRNA的表达。(10)Co-immunoprecipitate检测IκBα与P65/P50的复合物间的作用。 结果 1.各组大鼠血压水平: 实验整个过程,与同周龄WKY组相比,SHR组血压升高(P＜0.05);与SHR组相比,通心络组血压降低(P＜0.05)。 2.各组大鼠体重及左室相对质量(LVM/BW): 实验整个过程,与同周龄WKY大鼠相比,SHR组体重下降(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组体重未见显著改变(P＞0.05)。 实验末,与WKY组相比,SHR组LVM/BW升高(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组LVM/BW下降(P＜0.05)。 3.超声心动图监测: 常规超声心动图指标:实验前,与WKY组相比,SHR组、通心络组LVEDD减小(P＜0.05),LVPWD、IVSD增加(P＜0.05),E峰、E/A、Ea、Ea/Aa无显著性差异(P＞0.05):与SHR组相比,通心络组上述指标未见显著改变(P＞0.05)。实验后,SHR、通心络组较WKY组LVEDD减小(P＜0.05),SHR组较通心络组LVEDD减小(P＜0.05);SHR组、通心络组较WKY组LVPWD、IVSD增加(P＜0.05),SHR组较通心络组LVPWD、IVSD增加(P＜0.05);SHR组较通心络组、WKY组E峰、E/A、Ea峰、Ea/Aa降低(P＜0.05),通心络组较WKY组Ea/Aa降低(P＜0.05),E峰、E/A、Ea无显著性差异(P＞0.05),3组间的A峰差异均不显著(P＞0.05);SHR较WKY和通心络组的DTe、IVRT延长(P＜0.05),通心络组较WKY组DTe、IVRT延长(P＜0.05)。实验前和实验结束各组间的FS、EF无显著性差异(P＞0.05)。 IBS参数:实验前,各组大鼠室间隔、左室后壁的AⅡ,PPI和CAI无显著差异(P＞0.05)。实验后,SHR组、通心络组较WKY组AⅡ、CAI升高(P＜0.05),PPI降低(P＜0.05);通心络组较SHR组AⅡ、CAI降低(P＜0.05),PPI升高(P＜0.05)。 4.血流动力学检测: 与WKY组相比,SHR组LVEDP升高(P＜0.01),+dp/dtmax、-dp/dtmax下降(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组LVEDP下降(P＜0.01),±dp/dtmax升高(P＜0.01)。 5.透射电镜观察超微结构的改变 WKY组左室心肌组织细胞排列整齐,心肌细胞质膜连续、完整;粗细肌丝排列整齐,肌小节及明暗各带清晰可见;线粒体丰富、大小均一、圆形或椭圆形;核膜光滑完整,异染色质成簇状聚集在核周部:闰盘清晰、连续,结构完整;细胞间质可见成纤维细胞和少量胶原纤维;微血管管腔大小正常,内皮细胞结构正常。 SHR组左室心肌组织细胞排列紊乱,质膜模糊、断裂;肌原纤维呈灶性溶解,肌丝扭曲、断裂,肌节对位不齐;线粒体明显增多,呈堆积状,肿胀、可见指纹状线粒体;核形状极不规则,多见深的切迹,常染色质呈团块状聚集;闰盘扭曲模糊断裂;间质可见大量胶原纤维分布;微血管管腔狭窄,内皮细胞肿胀明显,呈柱状向管腔突起。 通心络组左室心肌组织总体较SHR组明显好转,细胞排列较整齐;肌原纤维断裂、溶解现象好转,可见T管系统略有扩张;线粒体大小较一致,排列较规整,未见指纹状线粒体;核形状较SHR组规则,闰盘基本连续,间质内胶原堆积明显好转,微血管腔内皮细胞肿胀好转。 6.组织病理观察 HE染色切片上,WKY组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;SHR组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,可见肌纤维断裂、排列紊乱;通心络组较SHR组明显好转,心肌细胞排列较规整,肌纤维断裂少见,细胞核较规则。 7.Masson染色胶原含量的检测 Masson染色显示胶原纤维呈蓝绿色,心肌纤维呈红色。镜下可见WKY组胶原组织分布均匀,排列整齐;SHR组心肌间质胶原纤维明显增多,围绕心肌细胞的胶原纤维断裂、排列紊乱;通心络组较SHR组心肌间质胶原纤维明显减少,相邻细胞的胶原纤维排列整齐。 定量分析显示:与WKY组相比,SHR组心肌胶原容积分数(CVF)升高(P＜0.01):与SHR组相比,通心络组心肌CVF降低(P＜0.05)。 8.免疫组织化学染色分析 P65,P50免疫组织:染色阳性信号为棕黄色颗粒,主要是心肌细胞核表达。WKY组心肌细胞核着色弱且分布均匀;而SHR组心肌细胞核着色分布广且呈强阳性染色,核内P65,P50的核表达较WKY组增加(P＜0.01),通心络组较SHR组核着色变弱,分布局限,P65,P50的核表达减少(P＜0.05)。 9.Western bolt检测Phospho-IκBα,P65和P50蛋白与WKY组相比,SHR组心肌细胞浆中Phospho-IκBα蛋白增多(P＜0.01),细胞核中P65、P50蛋白增多(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组心肌心肌细胞浆中Phospho-IκBα蛋白降低(P＜0.05),细胞核中P65、P50蛋白降低(P＜0.05)。 10.实时定量RT—PCR检测P65等基因的mRNA表达 P65 mRNA表达:与WKY组相比,SHR组心肌P65 mRNA表达升高(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组心肌P65 mRNA表达下降(P＜0.01)。 MMP-9和TIMP-1 mRNA表达:与WKY组相比,SHR组心肌MMP-9 mRNA表达升高(P＜0.01),TIMP-1 mRNA表达升高(P＜0.01),MMP-9/TIMP-1升高(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组心肌MMP-9 mRNA表达及MMP-9/TIMP-1升高(P＜0.05),TIMP-1mRNA表达降低(P＜0.01)。 CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达:与WKY组相比,SHR组心肌CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达升高(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组心肌CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达下降(P＜0.05)。 11.Co-immunoprecipitate检测IκBα与P65/P50的复合物间的作用 与WKY组相比,SHR组心肌IκBα与P65/P50的复合物增多(P＜0.01);与SHR组相比,通心络组心肌IκBα与P65/P50的复合物增多(P＜0.05)。 结论 1.SHR于20周龄时发生了心肌重构、尤其是发生了细胞外基质的重构,并出现了心脏舒张功能的异常。 2.通心络可减轻SHR,心肌重构尤其是细胞外基质的重构,并能改善左室舒张功能。 3.通心络抑制心肌重构可能机制是通过抑制转录因子P65和P50蛋白的表达及IκBα与P65/P50的复合物的形成,进而调节其下游基因CollagenⅠ、CollagenⅢ、MMP-9及TIMP-1的表达。