收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究

王庆杰  
【摘要】: 随着基因工程的发展,微生物表面展示系统已发展出噬菌体展示系统、细菌表面展示系统、酵母表面展示系统等,广泛应用在生物学研究及工业生产的许多领域,例如研究蛋白质-蛋白质之间的相互识别与相互作用、由多肽构象或蛋白质突变库中获取特定功能蛋白、生产抗体、生产口服疫苗、开发全细胞催化剂、开发生物传感器、开发细胞吸附剂等等,成为竞相研究的热点。 但已发展的微生物表面展示系统都存在自身明显的缺陷:噬菌体展示系统展示的多肽或蛋白分子量不能太大,否则会影响噬菌体的装配与感染;革兰氏阴性菌表面展示系统表达的重组蛋白易以包涵体形式存在,展示的蛋白不仅要通过质膜层,还要在外膜上正确的整合,这可能对展示蛋白的结构和活性产生影响;革兰氏阳性菌细胞壁厚,转化效率较低,这样会影响大容量肽库的构建;两种细菌表面展示系统均缺乏翻译后修饰功能,容易使展示的真核蛋白失活;酿酒酵母中虽存在蛋白质翻译后修饰,但糖基化方式与哺乳动物不同,它对外源蛋白N-糖基化修饰形式是高甘露糖型,糖链平均为50-150甘露糖残基,并且核心寡糖末端是α-1,3-甘露糖,从而使生产的蛋白在人体中有比较强的免疫原性,过度糖基化还可能使表达的酶等功能性蛋白失活。 毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。其具有易于培养、繁殖快、具有乙醇氧化酶基因诱导型强启动子,可调控外源基因的表达、可对外源蛋白进行更接近高等生物的加工折叠和翻译后修饰、便于基因工程操作和高密度发酵等的特性,成为微生物表面展示系统极有应用前景的宿主菌。 目前已有的毕赤酵母表面展示系统主要是利用来自酿酒酵母Flo1蛋白的N端絮凝结构域为锚定蛋白将外源蛋白展示于菌体表面,融合蛋白非共价连接于毕赤酵母细胞壁上。展示的外源蛋白通过N端与锚定蛋白融合,C端蛋白游离,这样的系统适合脂酶等活性位点在C端的功能蛋白。但对活性位点在N端的功能蛋白表达不利,限制了更广泛的应用。为丰富毕赤酵母展示系统,展示不同需要的外源蛋白,本文做了以下3部分工作: 第一部分:Pir1型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究 Pir(Proteins with internal repeats)系列蛋白是酿酒酵母中共价连接细胞壁的甘露糖蛋白,C端无保守的GPI锚定序列,直接与细胞壁中β-1,3-葡聚糖相连。成熟肽蛋白N端有数目不等的重复序列,可被温和碱(30 mM NaOH,12h,4℃)从细胞壁抽提。外源蛋白可通过与Pir蛋白N端融合、C端融合或插入融合展示在菌体表面。目前Pir系列蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。 本研究克隆了来自酿酒酵母EBY100的Pir1蛋白成熟肽基因(Pir1-a),连接入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,构建了新型毕赤酵母表面展示的通用载体pPIC9K-Pir1-a。利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞外。通过免疫荧光分析以C端与Pir1-a蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP),证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。但激光荧光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察到EGFP-Pir1-a融合蛋白的展示是不规则的,分析这种不规则的展示可能与Pir1蛋白自身性质相关。进一步以Pir1成熟肽N端重复序列(Pir1-b蛋白)为锚定蛋白,构建新的毕赤酵母表面展示载体pPIC9K-Pir1-b,表面展示的模式蛋白仍采用EGFP。CLSM观察到新的融合蛋白EGFP-Pir1-b是规则的展示在重组毕赤酵母表面。Western blot证明了融合蛋白EGFP-Pir1-a与EGFP-Pir1-b可被温和碱从重组毕赤酵母细胞壁抽提,并且很少分泌到培养基中。荧光分光光度计及流式细胞仪检测发现,分别以Pir1-α和Pir1-b为锚定蛋白时,相同诱导条件下,表面展示EGFP的重组毕赤酵母菌株的荧光强度是相当的。以上结果说明酿酒酵母的Pir1蛋白可作为毕赤酵母的锚定蛋白,将外源蛋白展示于毕赤酵母表面,融合蛋白没有改变Pir1蛋白自身的锚定性质:同时说明了Pir1成熟肽蛋白中,其N端重复序列对其锚定在细胞壁起主要作用,C端序列对其在表面的不规则展示起主要作用。 第二部分:α凝集素型毕赤酵母表面展示系统的构建及毕赤酵母表达重组蛋白纯化新方法的探讨 α凝集素是是酿酒酵母中共价连接细胞壁的GPI(Glycosyl phosphatidylinositol)型甘露糖蛋白的一种,C端有GPI锚定序列,并通过β-1,6-葡聚糖连接至β-1,3-葡聚糖,可被β-1,3-或β-1,6-葡聚糖酶作用。外源蛋白可通过C端与α凝集素C末端融合表达而锚定在细胞表面。目前以α凝集素C末端为锚定蛋白在酿酒酵母表面已成功展示了多种外源蛋白。 本研究克隆了来自酿酒酵母EBY100的α凝集素的C末端基因,连接入毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K中,构建了新型毕赤酵母表面展示通用载体pPIC9K-AGα1。利用α-factor信号肽将外源蛋白引导分泌至细胞外,同时在锚定蛋白序列前增加了MluI、ApaI限制性内切酶位点及Xpress抗原序列,提供了肠激酶作用位点。通过免疫荧光分析以C端与α凝集素的C末端蛋白融合而展示于毕赤酵母表面的EGFP,证明新的毕赤酵母表面展示系统的构建是成功的。通过荧光显微镜观察及Western blot分析证明了肠激酶可将展示在重组毕赤酵母表面的EGFP与菌体分离,从而探讨了纯化毕赤酵母表达重组蛋白的新方法:外源蛋白可利用毕赤酵母的体系进行需要的折叠、翻译后修饰并分泌到胞外,通过锚定蛋白展示于菌体表面,经肠激酶作用,可从菌体表面分离下来。 第三部分:两种毕赤酵母表面展示系统展示外源蛋白能力的比较 在成功地以来自酿酒酵母的Pir1蛋白及α凝集素C末端为锚定蛋白构建了毕赤酵母表面展示系统的基础上,以通过C端分别与两种锚定蛋白融合的EGFP为报告蛋白,通过研究诱导温度、诱导时间、诱导培养基初始pH、甲醇诱导浓度等摇瓶培养的发酵条件,探讨不同发酵条件分别对两种重组毕赤酵母菌株表面展示融合蛋白的影响。并在两者各自最适的发酵条件下对其展示外源蛋白的能力进行比较,结果发现α凝集素C末端为锚定蛋白时,其展示通过C端与其融合的外源蛋白的能力强于Pir1成熟肽蛋白。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前11条
1 邹晨伟;黄义德;;毕赤酵母引导外源蛋白分泌的信号肽研究进展[J];生物技术通讯;2020年06期
2 李洪淼,王红宁,许钦坤;毕赤酵母高密度发酵研究进展[J];生物技术通讯;2005年02期
3 张娜;李江华;金鹏;堵国成;陈坚;康振;;阶段控温提高透明质酸酶在毕赤酵母中的表达[J];食品与生物技术学报;2016年12期
4 余占桥;马青山;赵龙妹;张日俊;;毕赤酵母优化表达外源蛋白策略[J];微生物学通报;2010年07期
5 王梦飞;朱红;焦宏亮;周华;蔡恒;;一株抗氧化酵母的分离、鉴定及抗氧化转录谱分析[J];生物加工过程;2020年06期
6 刘茗铭;赵金松;边名鸿;杨赟;冯方剑;;酒曲中产香酵母的筛选及产香特性分析[J];酿酒;2021年01期
7 慕丽琴;冯汉青;;植物内生酵母研究简况[J];生物学通报;2021年02期
8 孟秋;章亭洲;;西方许旺酵母及其工业应用概述[J];饲料博览;2021年04期
9 黄思鸿;张晓辉;罗娜;叶梅;钟葵章;;啤酒生产中酵母细胞酸化力与酵母活性、酵母发酵性能的关联性研究[J];中外酒业;2021年07期
10 刘孟健;张文举;姚峻;牛俊丽;;酵母壁多糖的生物学功能及其对反刍动物的影响[J];饲料工业;2020年05期
11 李晓欢;何宏魁;李冬冬;李兰;曹润洁;周庆伍;;高耐受酿酒酵母的筛选及酵母曲制备工艺的优化[J];酿酒科技;2020年02期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 余占桥;马青山;赵龙妹;张日俊;;毕赤酵母优化表达外源蛋白策略[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(下册)[C];2010年
2 白逢彥;王啟明;劉新展;Bart Theelen;Marizeth Groenewald;Teun Boekhout;;擔子菌酵母的多基因系統發育分析與分類系統更新[A];第十二届海峡两岸真菌学学术研讨会大会手册壁报论文摘要集[C];2015年
3 梁旺;孔德生;蔡旭;郭泓坤;彭卓醇;刘静;马端;;组织因子途径抑制物基因的改造及其在毕赤酵母中的表达[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
4 王家骥;练玉银;聂湘辉;林燕棉;李爱美;;早孕因子在中国仓鼠卵巢细胞和毕赤酵母中的表达[A];中国毒理学会免疫毒理专业委员会2014年学术会议论文汇编[C];2014年
5 张彦;;即食酵母——营养型减肥,科学减肥新方式[A];2008第二届中国保健协会减肥分会年会暨(安琪纽特)美丽健康产业创富论坛汇编[C];2008年
6 杨科利;李前忠;林昊;;酵母转录因子结合位点的理论预测[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年
7 王革;王妍;何凌冰;乔刚;朱一松;王君艳;;酵母分泌表达重组人神经生长因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年
8 蒲广西;邓刚;符启骄;周湘龙;符兆理;陈海宁;郝新保;白玉杰;梁国栋;;毕赤酵母发酵生产重组人粒细胞集落刺激因子[A];海南生物技术研究与发展研讨会论文集[C];2006年
9 张建国;;毕赤酵母吞噬过程中酶活力和能荷变化[A];2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会论文摘要集[C];2015年
10 张怀渊;赵建新;陈永泉;张灏;陈卫;宋元达;;耶氏解脂酵母油脂积累分子机制的初步探索[A];中国食品科学技术学会第八届年会暨第六届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2011年
11 蹇华丽;;物化因子结合诱变选育耐温型法夫酵母[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
12 戴俊彪;;酵母染色体的设计与合成[A];中国生物工程学会第二届青年科技论坛暨首届青年工作委员会学术年会论文集[C];2017年
13 罗姮;刘延鹏;王海英;邱振鲁;李长田;许宰铣;;地衣共生真菌Umbilicaria muehlenbergii由酵母型向菌丝型转化的诱导因素初探[A];2012年中国菌物学会学术年会会议摘要[C];2012年
14 曾丽清;宋浩雷;施碧红;施巧琴;;Aspergillus tamarii FS132脂肪酶基因在毕赤酵母的有效表达[A];第六届中国酶工程学术研讨会论文摘要集[C];2007年
15 刘天明;王庆国;王慧;刘波;刘庆军;刘惠英;;新疆野生酵母物种多样性研究[A];微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C];2008年
16 李春丽;李桃生;;酵母糖化酶基因剂量效应的研究[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
17 史勇;郝林琳;于浩;金晶;刘松财;;甜味蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
18 钱志坚;匡达人;;啤酒酵母五号染色体ARS的克隆[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
19 罗进贤;许弈阳;张添元;;人血管生成抑制素基因在汉生酵母中的表达[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
20 汤丹;刘松财;史勇;李莉;张英;郝林琳;;甜味蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 王庆杰;新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究[D];山东大学;2008年
2 卢黄娉;几丁质对海洋酵母Rhodosporidium paludigenum果实采后病害防治效力的影响及相关机理研究[D];浙江大学;2015年
3 沈伟;毕赤酵母醇氧化酶启动子调控相关激酶的研究与应用[D];华东理工大学;2017年
4 刘钰山;人白介素25在毕赤酵母中的重组表达、纯化和活性研究[D];复旦大学;2011年
5 张怀渊;底物供应对产油酵母Yarrowia lipolytica油脂积累影响机制[D];江南大学;2015年
6 胡浩;西藏罗伦隐球酵母对水果采后病害的防治效果及相关机理研究[D];浙江大学;2016年
7 王虎玄;浓缩苹果汁全产业链高渗酵母分离鉴定及电子鼻快速检测方法研究[D];西北农林科技大学;2016年
8 盛军;海洋金黄色隐球酵母菊粉酶发酵生产、酶的分离纯化以及基因克隆的研究[D];中国海洋大学;2008年
9 俞志敏;啤酒超高浓酿造中酵母代谢的分析与调控[D];华南理工大学;2011年
10 龚方;海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的发酵生产、纯化、特性、基因克隆与表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
11 邹冬辉;重组人前列腺特异性抗原在毕赤酵母中的表达和活性测定[D];吉林大学;2004年
12 金超;转基因法夫酵母高产3S,3'S虾青素的研究[D];天津大学;2011年
13 熊莲;油脂酵母高效处理丁醇发酵废水机理与集总动力学研究[D];华南理工大学;2015年
14 高玲美;高蛋白海洋酵母的初步研究[D];中国海洋大学;2007年
15 迟春萍;人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究[D];吉林农业大学;2011年
16 刘朔;纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D];南京农业大学;2007年
17 迟爽;提高法夫酵母合成虾青素水平的策略及代谢调控特征分析[D];中国农业大学;2016年
18 倪贺;酵母来源血管紧张素转移酶抑制多肽的制备及其抑制机理的研究[D];华南理工大学;2012年
19 张慧(Farzana Rashid);Hepcidin 20基因克隆及在毕赤酵母中的表达[D];北京化工大学;2009年
20 李晓宇;海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 李文玲;酵母活力测定方法的建立及高活力酵母的培养[D];江南大学;2011年
2 王媛媛;含活酵母啤酒的研究[D];江南大学;2009年
3 杨志华;利用含铬废革料制备富铬酵母的研究[D];四川大学;2002年
4 倪靖岳;酵母甘露聚糖的生产技术研究[D];河北科技大学;2015年
5 李国良;浓缩苹果汁中耐高渗酵母的检测与控制技术[D];西北农林科技大学;2012年
6 王泽;凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达[D];河南师范大学;2011年
7 吴琳;抗感染新靶点分选酶A的酵母展示系统的构建研究[D];华南理工大学;2010年
8 曹晓娟;半胱胺和酵母铬对仔猪和生长猪生产性能的影响及其调控机理的研究[D];山西农业大学;2004年
9 金花;微生物发酵法研制富铬酵母[D];吉林大学;2004年
10 李志勇;富含核黄素营养酵母的研究[D];天津科技大学;2004年
11 葛少林;不同来源的谷胱甘肽合成酶对重组毕赤酵母合成谷胱甘肽的影响研究[D];中国科学技术大学;2011年
12 许永利;毕赤酵母糖基化初步研究[D];江南大学;2011年
13 石秀侠;复合诱变选育富铬酵母及其培养条件优化研究[D];安徽农业大学;2006年
14 丁满生;食用营养酵母的研究[D];天津科技大学;2001年
15 蒋秋琪;改造毕赤酵母提高谷胱甘肽的合成效率[D];江南大学;2020年
16 钱鹏;黑曲霉糖化酶基因在酵母中克隆和表达[D];安徽工程大学;2012年
17 牟旭鹏;人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2006年
18 张齐全;代谢工程改造毕赤酵母生产肌醇[D];中国农业科学院;2021年
19 张东晓;毕赤酵母高密度发酵工艺和水解工艺的优化[D];华中农业大学;2011年
20 齐烁;高浓度酵母废水生化处理技术的试验研究[D];华南理工大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 赵熙熙;首个合成酵母染色体问世[N];中国科学报;2014年
2 本报记者 杨济华;从酵母到鳕鱼[N];中国科学报;2013年
3 艾栗斯;酵母 与人类同行的微生物[N];北京日报;2021年
4 记者 郝晓明;实施基因精准编辑 毕赤酵母变高效“细胞工厂”[N];科技日报;2021年
5 本报实习生 池涵 记者 丁佳;“佛系”酵母的大智慧[N];中国科学报;2019年
6 本报首席记者 李霄楠;发挥“酵母”作用 让群众从“边上看”到主动干[N];鹤壁日报;2019年
7 本报记者 丁佳;人造酵母:捅破生命界限的“窗户纸”[N];中国科学报;2018年
8 唐一尘;科学家找到优化酵母新途径[N];中国科学报;2018年
9 记者 张梦然;不同类型酵母杂交促进各类啤酒出现[N];科技日报;2019年
10 记者 陶婷婷 通讯员 升恭;甲醇酵母合成生物学研究获最新进展[N];上海科技报;2018年
11 记者 佘惠敏;我国揭示酵母酶的“钻戒”结构[N];经济日报;2018年
12 经济日报·中国经济网记者 沈慧;人造酵母诞生记[N];经济日报;2018年
13 湖北日报全媒记者 邓伟;冷建新:酵母“魔术师”[N];湖北日报;2018年
14 安杰;张家口局力促酵母出口快速增长[N];中国国门时报;2010年
15 安杰;张家口检验检疫局促酵母出口快速增长[N];中国食品质量报;2010年
16 张海波 张彦 陈蓉;功能酵母及其衍生物研究进展(一)[N];中国食品报;2010年
17 邱志达;上海总队一支队发挥典型酵母作用推动全面建设[N];人民武警;2005年
18 通讯员 黄驰 邱志达 记者 刘建;武警上海总队一支队发挥先进的酵母作用[N];法制日报;2009年
19 单士兵;科技创新的“酵母”是什么[N];成都日报;2006年
20 华文;我国酵母进口大幅增长[N];中国食品质量报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978