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可控酶解水蛭制备抗凝血肽的研究

武建卓  
【摘要】: 水蛭作为一味传统活血化瘀中药,具有破血、逐瘀、通经之功能,随着近年来对活血化瘀治疗各种疑难病研究的不断深入,水蛭的药用也倍受青睐。在中医临床上用单味水蛭或配伍复方,使用煎剂、散剂、胶囊剂和口服液等剂型,内服给药,治疗心脑血管疾病疗效显著。但是这类水蛭制剂由于具有水蛭药材的腥臭味,不良反应较多,同时由于成分复杂,不易控制药材质量,采用传统的提取、浓缩工艺方法,使有些成分分解、破坏,或提取不出来,易使有效成分损失,药效波动大,亟待研发新的水蛭制剂以满足临床需求。 本课题在中医药理论的指导下,采用可控酶解、超滤、琼脂糖离子交换层析等生物制药技术对样品进行纯化,从而得到纯度高、生物活性强的低分子量水蛭抗凝血肽(HAP),并对其抗脑缺血活性进行了研究,主要研究内容如下: 1、水蛭可控酶解工艺研究 以抗凝血活性为主要指标,研究了影响酶解方法的主要因素:蛋白酶种类、酶用量、底物浓度、酶解液pH值、酶解温度及酶解时间。通过试验,确定了最优的酶解条件:采用胰蛋白酶,酶用量5000NFU·g~(-1),底物浓度10%,调节pH8.5,控制酶解温度50℃,酶解时间8h。 2、HAP分离纯化及性质研究 以抗凝血活性为主要指标,分别比较了不同浓度的有机溶剂、不同分子截留量的超滤膜、不同色谱条件对产物活性的影响,确定了HAP的分离纯化条件:酶解液加2倍量的丙酮沉淀,上清夜回收丙酮后加水稀释,0.22μm微孔滤膜滤过后经5kD的超滤膜超滤,收集超滤液,浓缩,通过经二乙醇胺-盐酸(pH9.0)平衡的Q-Sephrose FF色谱柱,先用两倍量的上样缓冲液洗去未结合部分,再以1mol·L~(-1) NaCl溶液洗脱,收集洗脱液,G10脱盐,浓缩,冷冻干燥,得HAP;测得肽含量为53.3%,采用紫外光谱法、红外光谱法、质谱法研究产物结构特点。 3、HAP活性研究 采用MCAO模型大鼠,观察到HAP组16mg·kg~(-1)、8mg·kg~(-1)组可明显改善大鼠神经症状,降低脑梗塞范围,与模型组相比具有显著差异;HAP组16mg·kg~(-1)、8mg·kg~(-1)可明显升高缺血再灌注大脑的SOD、GSH、GSH-PX含量,降低MDA、LDH、NO含量,HAP16 mg·kg~(-1)组可明显升高缺血再灌侧大脑的Na~+-K~+-ATPase和Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase的活性。 采用小鼠冷水负重游泳后断头全脑缺血模型,观察到HAP20mg·kg~(-1)、10mg·kg~(-1)、5mg·kg~(-1)可明显增加小鼠断头呼吸时间。 采用体外法,观察到HAP具有一定的溶栓作用;采用动—静脉旁路血栓形成方法,观察到HAP16mg·kg~(-1)、8mg·kg~(-1)、4mg·kg~(-1)可不同程度减少动静脉环路血栓的湿重。 采用体外法,观察到HAP可以延长健康人血浆APTT及PT,并能抑制ADP诱导的健康人血小板聚集。 本课题取得的主要成果: 成功的采用可控酶解法制得HAP,所得产物肽含量达53.3%,符合《药品注册管理办法》中中药、天然药物注册分类5的技术要求; 采用多个动物模型,对HAP的多方面的药效学试验进行研究,证实了HAP对缺血性中风有着很好的疗效,为水蛭抗凝血肽的开发打下坚实的基础。


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