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谷氨酰胺合成酶对Escherichia coli和Pseudomonas putida生物膜形成的影响

徐琛  
【摘要】: 生物膜(biofilms)是细菌吸附在有机或无机介质上时,通过分泌含表面多糖、蛋白、DNA的细胞外基质,将菌群包围其中所形成的复合体。在自然界中,细菌主要以生物膜形态存在。生物膜结构为内部菌群提供了物理性防护,生物膜中的菌体可形成互养共栖关系协同进行新陈代谢,遗传物质可横向转移使得进化更快,生物膜的形成对微生物提供了生态学优势。 生物膜的形成受多种因素影响,外界环境条件如水文条件、吸附介质、营养物质、光照、温度等,细菌内在的调节机制如密度感应系统都可影响生物膜形成。与浮游态相比细菌在形成生物膜时多种基因差异表达,差异表达的基因包括细菌吸附过程、密度感应系统、代谢、应答环境压力、分子伴侣相关的基因。 在前期实验中通过蛋白质双向凝胶电泳等技术研究发现,恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)与浮游态相比在生物膜形成过程中有多个基因差异表达,本实验选取其中一个差异表达的蛋白——谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)通过该基因的过量表达、抑制和敲除以研究其对生物膜形成的影响。 本文用恒流器模拟自然界中流体环境,以低营养的Hutner盐液为培养基,以载玻片为吸附介质培养Pseudomonas putida和Escherichia coli,培养温度30℃,储液罐进液流速15mL/h,空气进入速度14-16mL/s,使其在载玻片上形成生物膜。通过显微镜观察生物膜形成过程。P.putida培养时间0-60h时为粘附聚集阶段,60-84h为微菌落形成阶段,84h后为生物膜成熟阶段。E.coli培养时间为0-72h时为粘附聚集阶段,72-96h为微菌落形成阶段,96h后为生物膜成熟阶段。 通过数据库检索获得E.coli gln gene全长序列。利用PCR扩增出谷氨酰胺合成酶基因,将gln与质粒pBC KS+连接构建出gln gene表达载体pBC KS-glnhb,并进行表达。利用恒流器培养E.coli-pBC KS-glnhb形成生物膜,观察其生物膜形成状况。与E.coli同期相比谷氨酰胺合成酶过量表达的菌体生物膜形成能力较弱,菌群的密度和厚度均有减少,谷氨酰胺合成酶的过量表达对生物膜形成有较大影响。 利用反义RNA与gln gene的mRNA互补结合后可干扰gln gene正常表达,本实验将E.coli gln gene的反义链连接入质粒,构建出反义核酸载体pBCKS-glnbh,并转入E.coli DH5α,转化后的重组子可用于利用RNA干扰检测谷氨酰胺合成酶不同表达对生物膜形成的影响。同时构建出P.putida中谷氨酰胺合成酶表达载体pBC KS-gsxb和反义核酸载体pBC KS-gsex。并利用融合PCR构建谷氨酰胺合成酶基因的同源片段,为进一步的通过同源重组替换谷氨酰胺合成酶基因实现基因敲除奠定基础。


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