慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测与分析

【摘要】： 研究背景和目的 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)治疗的关键为抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)治疗。目前被我国国家食品药品监督管理局(State Foodand Drug Administration,SFDA)批准用于抗HBV治疗的药物主要包括两类:干扰素类与核苷(酸)类似物类,后者包括拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)、替比夫定(telbivudine,LdT)与恩替卡韦(entecavir,ETV)。其中ADV自上市以来,在CHB患者,尤其是LAM耐药患者中被广泛应用。但随着ADV治疗时间延长,ADV耐药的问题逐渐凸显。目前关于ADV耐药相关的HBV反转录酶(reverse transcriptase,rt)区变异位点报道较多,如rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtI233V与rtN238T/D等,但公认的ADV耐药相关的HBV变异为rtA181V/T与rtN236T。ADV治疗e抗原(HBeAg)阴性的核苷(酸)类似物初治CHB患者1～5年累积耐药发生率分别为0%、3%、11%、18%与29%。患者出现ADV耐药相关变异后,可以相继出现病毒学突破、生化学突破、肝炎发作与肝功能失代偿等。因此定期监测、早期发现ADV耐药并给予有效的挽救治疗对于有效地控制HBV感染具有重要意义。在ADV耐药的监测中,血清HBV DNA检测是重要的筛查指标。但是血清HBV DNA除受到ADV耐药影响外,还与患者依从性、患者应用药物的质量、药物代谢因素以及体内病毒的自然波动等相关,而特异性的ADV耐药检测则是确诊患者ADV基因型耐药的方法。 现已报道的ADV基因型耐药(genotypic resistance)的检测方法包括:聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)产物直接测序法、克隆测序法、线性探针反向杂交法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(restriciton fragmentlength polymorphism,RFLP)、实时荧光定量PCR法与限制性片段质谱多态性(restriciton fragment mass polymorphism,RFMP)等方法。在这些方法中,实时荧光定量PCR法目前尚未应用于临床检测;线性探针反向杂交法与RFMP法价格昂贵;克隆测序法操作非常繁琐而且价格昂贵。目前国内ADV耐药检测应用最广泛的是PCR产物直接测序法与PCR-RFLP法。PCR产物直接测序法目前多采用双脱氧测序法(di-deoxy sequencing),其缺点为检测敏感度较低,只有当变异病毒占体内病毒群20%～30%以上时方可检出。PCR-RFLP法成本相对低廉,但仅针对已知变异,对每种变异均需设计特异性引物与酶切位点,且受到操作人员以及酶切体系影响较大。随着ADV耐药问题的逐渐凸显,临床上迫切需要有较高敏感度与特异度、操作简便、自动化程度高并且价格相对低廉的耐药检测方法。 基因芯片技术用于疾病诊断具有高通量与高灵敏度的优点,它用于LAM耐药的检测已有报道,检测HBV DNA下限为2～3 log_(10)拷贝/mL,可于病毒群中检出＞10%变异株。另外焦磷酸测序法作为一种新兴的测序方法,已有报道用于LAM耐药检测,同样肯有高通量与高灵敏度特点,并可于病毒群中检出＞10%变异病毒。目前尚无基因芯片法与焦磷酸测序法检测ADV耐药的报道。 因此,我们收集ADV治疗出现病毒学突破或治疗48周未达到病毒学应答的CHB患者的血清样本与临床资料,采用PCR产物双脱氧测序法、焦磷酸测序法与基因芯片法进行ADV耐药检测,对三种方法检测结果进行分析。同时,我们进一步比较ADV治疗病毒学突破患者与48周无病毒学应答患者的耐药发生情况,分析耐药相关因素;并比较HBV基因型与ADV耐药的相关性。具体内容分述如下: 第一部分:慢性乙型肝炎患者阿德福韦酯耐药的检测方法分析 本部分实验,我们收集ADV治疗出现病毒学突破或48周未达到病毒学应答患者的血清,分别应用PCR产物双脱氧测序法、焦磷酸测序法与基因芯片法进行基因型耐药检测。对三种检测方法的耐药检测结果进行分析,探讨漏检耐药变异的原因,并对变异株在病毒群中所占比率(以下简称变异株比率)做初步探讨。 材料和方法: 1.收集ADV治疗(10mg/d)出现病毒学突破(病毒学突破组)或48周未达到病毒学应答患者(病毒学失败组)血清提取DNA模板,巢式PCR扩增后取阳性扩增的产物进行双脱氧法测序,采用NTI Vector 9与Chromas软件分析测序结果。 2.取患者血清提取DNA模板,PCR扩增后取阳性扩增的产物采用基因科技(上海)HBV耐药突变焦磷酸测序法检测试剂盒进行检测。采用焦磷酸测序仪配套分析软件进行变异判断与变异株比率分析。 3.取患者血清提取DNA模板,PCR扩增后取阳性扩增的产物采用晶芯乙型肝炎病毒耐药检测基因芯片试剂盒进行检测,检测结果采用晶芯乙型肝炎病毒耐药基因芯片分析软件进行分析。 4.采用t检验、t′检验、Wilcoxon秩和检验、Pearson非校正法卡方检验或Yates校正法卡方检验进行统计分析。SPSS 11.5软件用于统计计算。 结果: 1.共检测病毒学突破组患者106例与病毒学失败组患者104例,两组患者性别比与平均年龄差别不存在统计学意义。 2.ADV耐药检测结果: (1).PCR产物双脱氧测序法耐药检测:210例患者PCR扩增均为阳性。病毒学突破组检出ADV耐药38例,病毒学失败组检出ADV耐药14例。 (2).PCR产物焦磷酸测序法检测:PCR扩增阴性患者10例(病毒学突破组5例,病毒学失败组5例)。病毒学突破组检出ADV耐药42例,病毒学失败组检出ADV耐药22例。 (3).基因芯片法检测:PCR扩增阴性患者21例(病毒学突破组12例,病毒学失败组9例)。病毒学突破组检出ADV耐药33例,病毒学失败组检出ADV耐药14例。 (4).由于双脱氧测序法与焦磷酸测序法为基于测序分析方法,其阳性结果可确认ADV耐药。此两种最终确定ADV耐药患者67例,其中病毒学突破组45例,病毒学失败组22例。共检出ADV耐药变异位点92个。基因芯片检测结果均得到双脱氧测序法和/或焦磷酸测序法的确认。 3.三种检测方法比较: (1).检测结果符合率:3种检测方法完全符合率为74.8%;双脱氧测序法与焦磷酸测序法结果符合率为83.8%;双脱氧测序法与基因芯片法结果符合率为83.3%;另外焦磷酸测序法与基因芯片法结果符合率为81.4%。 (2).就确认的67例ADV耐药患者对三种方法的耐药检出率比较:焦磷酸测序法耐药患者(P=0.002)以及耐药位点检出率(P=0.002)高于双脱氧测序法;焦磷酸测序法耐药患者(P＜0.001)以及耐药位点检出率(P＜0.001)高于基因芯片法。双脱氧测序法与基因芯片法耐药患者(P＞0.05)与耐药位点检出率(P＞0.05)差异无统计学意义。 (3).三种方法检测结果的阳性预测值:PCR产物双脱氧测序法与焦磷酸测序法可直接显示变异位点,其阳性预测值为100%。本研究中,基因芯片检测阳性结果均得到测序法的验证,其阳性预测值为100%。 4.漏检变异分析: (1).PCR产物双脱氧测序法漏检变异位点21个,漏检位点与患者血清HBVDNA水平与变异株在病毒群中所占比率相关。 (2).基因芯片法共漏检耐药变异位点29个,漏检位点主要与变异株的血清拷贝数相关,而与变异株在病毒群中所占比率无直接相关。 (3).焦磷酸测序法共漏检6个耐药变异位点。漏检位点原因尚不清。 5.检出变异的变异株比率分析: (1).rtA181T、rtA181V与rtN236T变异各自在检出时的平均变异株比率分别为38.96%、54.89%与54.01%。rtA181V平均变异株比率高于rtA181T(P=0.005)。rtA181V与rtN236T平均变异株比率差异无统计学意义(P＞0.05)。 (2).在病毒学突破组,单一位点变异患者共24例,其中14例患者变异株比率＜50%。在病毒学失败组中,单一位点变异患者共20例,其中12例患者变异株比率＜50%。 结论: 1.初步研究表明,PCR产物焦磷酸测序法的ADV耐药检出率优于双脱氧测序法与基因芯片法。基因芯片法耐药检出率与双脱氧测序法无显著性差异。焦磷酸测序法与双脱氧测序法检测阳性结果可以确认耐药,基因芯片法同样具有较好的阳性预测值。 2.PCR产物双脱氧测序法漏检变异位点与患者血清HBV DNA水平与变异株所占比率相关。基因芯片法漏检位点主要血清中变异株的拷贝数相关,而与变异株在病毒群中所占比率无直接相关。 3.无论是ADV治疗出现病毒学突破还是治疗48周无病毒学应答患者,其检出的耐药变异株在体内均可能以非优势株存在,体内变异株比率与患者HBVDNA改变的关系还有待进一步研究。 第二部分:CHB患者ADV耐药的相关因素分析 由上部分可知,无论是ADV治疗病毒学突破组患者还是病毒学失败组患者均只有部分患者检出耐药。因此我们就第一部分中患者的ADV耐药检测结果进一步比较病毒学突破组与病毒学失败组患者的耐药情况,分析耐药发生的相关因素;并分析HBV基因型与ADV耐药的相关性。 材料与方法 1.患者HBV基因型检测,采用巢式PCR方法扩增HBV表面抗原(HBsAg)编码序列,扩增产物进行测序分析,将测序结果输入美国生物技术信息中心(NCBI)HBV分型软件进行分型。 2.病毒学突破组与病毒学失败组患者ADV耐药检测参照论文第一部分。 3.采用t检验、t′检验、Wilcoxon秩和检验、Pearson非校正法卡方检验或Yates校正法卡方检验进行统计分析。SPSS 11.5软件用于统计计算。 结果: 1.病毒学突破组中基因B型患者18例,基因C型患者88例。病毒学失败组中基因B型患者21例,基因C型患者83例。两组均未检出其它基因型患者。 2.两种方法共检出ADV耐药患者67例,其中病毒学突破组45例,病毒学失败组22例。共检出耐药变异92个,其中rtA181V/T变异63个,rtN236T变异29个。病毒学突破组耐药患者检出率高于病毒学失败组(P＜0.001)。病毒学突破组联合变异检出率高于病毒学失败组(P=0.013)。病毒学突破组单一rtA181T变异患者比率低于病毒学失败组(P=0.017)。 3.病毒学突破组中,单一位点变异患者HBV DNA突破水平(P＞0.05)与生化学突破率(P＞0.05)与联合变异患者差别无统计学意义。包含rtA181T变异患者HBV DNA突破水平低于不包含该变异的耐药患者(P=0.014),但生化学突破率高于不包含该变异的耐药患者(P=0.023)。 4.两组患者中,基因B型与C型患者耐药发生率差别无统计学意义(P＞0.05)。基因B型ADV耐药患者中单一rtN236T变异患者比率高于基因C型ADV耐药患者(P=0.011)。 5.两组患者中LAM治疗失败患者ADV耐药检出率均高于ADV初治患者(病毒学突破组P=0.010;病毒学失败组P=0.020)。 结论: 1.ADV耐药变异中,rt181V/T变异较rtN236T变异常见,无论是ADV治疗病毒学突破患者还是治疗48周无病毒学应答患者均需进行耐药检测以指导抗病毒方案选择。 2.rtA181T变异可降低ADV治疗出现病毒学突破患者的HBV DNA升高幅度,但可增加患者生化学突破率;分析可能的原因与rtA181T变异导致的HBsAg变异相关。 3.基因B型ADV耐药患者中单一rtN236T变异所占比率高于基因C型ADV耐药患者,结果有待进一步确认。 4.无论是在病毒学突破人群还是治疗48周无病毒学应答人群,ADV耐药均多发生于LAM经治患者。