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DNA甲基化相关基因在子宫内膜癌细胞中的研究

崔敏  
【摘要】: 研究背景: 子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,根据其病因和病理组织学特点可分为子宫内膜样癌和非子宫内膜样癌两种类型,又可称为Ⅰ型子宫内膜癌和Ⅱ型子宫内膜癌。Ⅰ型约占子宫内膜癌的80%——90%,该型多起源于增生期子宫内膜;与雌激素过度刺激有关;雌、孕激素受体表达常为阳性。近年来的研究显示,表观遗传信息的改变在此型内膜癌的发生、发展中起重要的作用。 表观遗传改变主要包括DNA甲基化的丢失、获得以及组蛋白修饰为特征的染色质结构的变化等。这些表观遗传的改变,特别是启动子的超甲基化引起的基因沉默,影响着肿瘤发展的各个阶段。通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达,从而引起相应基因沉默,去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达,在肿瘤发生时,癌细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20——60%,同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记以及许多人类基因病(如癌症,心血管疾病,糖尿病等)发生发展都起重要的作用。因此,基因启动子区异常甲基化作为一种高灵敏度的标志物在多种人类疾病发生发展机制的研究中受到越来越多的重视,是目前新的研究热点之一。 DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制,是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下,基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳原子共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化后核苷酸顺序未变,而基因表达受影响。在哺乳动物中,与甲基化有关的DNA甲基转移酶(DNMT)有三种:DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。在发育过程中DNMT1主要作用是维持机体现存的DNA甲基化模式,而DNMT3A和DNMT3B主要是确立新的甲基化模式。三者间的关系目前还不太清楚,但编码3种酶的基因的mRNA和它们的表达蛋白在很多肿瘤细胞中都有过度表达,而且多种实验结果均提示三者可以分别通过直接或协同作用导致肿瘤细胞DNA异常甲基化。因此,它们在肿瘤细胞DNA甲基化的启动和维持中发挥着重要作用。有研究发现DNMT1和DNMT3B在子宫内膜癌中是过表达的,并且在高分化的内膜癌细胞系中的表达低于在低分化内膜癌细胞系中的表达水平,但其过表达的机制尚不清楚。 大约有5%的子宫内膜癌发生于具有较强遗传易感性妇女中,这种遗传易感性是由于和遗传性非息肉性样结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectalcancer,HNPCC)综合症相关的种系突变引起的,DNA修复基因的遗传性突变导致这些患者的肿瘤在整个基因组中出现大量的微卫星重复序列的突变,即微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)。HNPCC表现为早发结肠癌的家族性聚集,一些其他类型癌症的发病率也有升高,其中妇女最显著的是子宫内膜癌。而这种微卫星不稳定性也出现于不带有DNA修复基因种系突变的某些散发性子宫内膜癌中,研究表明这些病例中错配修复基因功能的丢失是由于错配修复基因(如hMLH1)启动子甲基化引起的不表达造成的,同时hMLH1启动子甲基化也见于子宫内膜增生过长及邻近癌肿的正常子宫内膜,这提示错配修复基因的启动子甲基化是内膜癌发生过程中的早期事件。目前认为广泛的甲基化导致一些抑癌基因和DNA错配修复基因的降表达,可能是某些内膜癌尤其是Ⅰ型内膜癌的特征。DNA错配修复功能的丢失将加速和细胞恶性转化有关基因的微卫星序列的突变,从而加速肿瘤的恶性转化过程。而子宫内膜癌中错配修复基因(如hMLH1)启动子甲基化与DNMT3B是否有直接的关系尚不确定。 DNA甲基化引起大量基因的失活,从而在肿瘤发生中起重要作用,因此通过抑制甲基化可重新激活相应的基因,以达到治疗肿瘤的目的,这为子宫内膜癌的治疗开辟了一条新的道路。 第一部分 17-β雌二醇对子宫内膜癌细胞中DNA甲基转移酶1和DNA甲基转移酶3B的表达及活性的影响 目的:子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,长期的雌激素过度刺激是子宫内膜癌发生的重要危险因素。近年来的研究显示,表观遗传的改变在此型内膜癌的发生、发展中起重要的作用。有学者发现DNMT1和DNMT3B在子宫内膜癌中是过表达的,并且在高分化的内膜癌细胞中的表达水平低于在低分化内膜癌细胞中的表达,但其过表达的机制尚不清楚。本研究利用人子宫内膜癌细胞系Ishikawa,探讨雌激素对Ishikawa细胞中DNMT1和DNMT3B表达及活性的影响。 方法: 1.Ishikawa细胞的培养:Ishikawa细胞在RPMI1640(添加10%FBS,2mM L-谷氨酸)培养基中贴壁生长。细胞在加药刺激前,在无酚红1640培养基中(添加5%碳吸附FBS,2mM L-谷氨酸)继续培养24h。 2.细胞周期的检测:实验分为五组:A对照组;B 10~(-6) M 17-β雌二醇组;C 10~(-8)M 17-β雌二醇组;D 10~(-10) M 17-β雌二醇组;E 10~(-12) M 17-β雌二醇组,加入不同浓度17-β雌二醇作用24h后,利用流式细胞术检测细胞周期的分布。 3.DNMT1和DNMT3B转录水平的检测:实验分为三组:a对照组;b 17-β雌二醇(10~(-8)M);c 17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M),加入药物作用24h后,Real-time PCR检测DNMT1和DNMT3BmRNA的表达。 4.DNMT1和DNMT3B蛋白水平的检测:实验分为三组:a对照组;b 17-β雌二醇(10~(-8)M);c 17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M),加入药物作用24h后,Western blot检测DNMT1和DNMT3B蛋白的表达。 5.17-β雌二醇作用后DNMT活性的检测:实验分为对照组和17-β雌二醇(10~(-8)M)组,药物作用24h后,检测DNA从头甲基化转移酶的活性。 结果: 1.不同浓度17-β雌二醇作用后对Ishikawa细胞增殖的影响:流式细胞术检测的细胞周期分布结果显示,与对照组相比,10~(-8)M 17-β雌二醇组S期所占的比值最大且与对照组相比较差异显著(P<0.05),即此浓度对细胞的增殖活性最强,因此选10~(-8)M作为17-β雌二醇的作用浓度。 2.17-β雌二醇对Ishikawa细胞中DNMT1和DNMT3B转录水平的影响:与对照组和17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M)组相比,17-β雌二醇(10~(-8)M)组DNMT3BmRNA表达显著增加(P<0.05);而17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M)组中DNMT3BmRNA表达较对照组虽有小幅度增加,但差异无显著性。ICI182780为雌激素受体拮抗剂,可拮抗雌激素的作用,加入ICI182780后DNMT3BmRNA表达水平较对照组并未见明显增加,提示DNMT3BmRNA表达的增加可能是雌激素受体途径介导的。为了进一步证明DNMT3BmRNA表达的增加不是雌激素刺激细胞增殖的结果,我们分别用GAPDH和PCNA标准化后结果仍然一致。然而,药物作用前后,DNMT1的表达未发现有明显改变。 3.17-β雌二醇对Ishikawa细胞中DNMT3B蛋白水平的影响:Western blot结果显示与对照组和17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M)组相比,17-β雌二醇(10~(-8)M)组DNMT3B蛋白表达显著增加(P<0.05);而17-β雌二醇(10~(-8)M)+ICI182780(10~(-8)M)组中DNMT3B蛋白表达较对照组虽有小幅度增加,但差异无显著性。分别用β-actin和PCNA标准化后结果仍然一致。 4.对DNMT活性的检测:与对照组相比,17-β雌二醇(10~(-8)M)作用24h后,DNA甲基转移酶从头甲基化的活性显著提高(P<0.05)。证明雌激素不但可以增加DNMT3B的表达,同时还使其活性提高。 结论: 1.雌激素可以显著增加子宫内膜癌细胞中DNMT3BmRNA和蛋白水平的表达,同时亦增加DNA甲基转移酶的活性,而雌激素对DNMT3B的上调有可能是通过雌激素受体途径实现的。 2.DNMT3B表达上调可导致肿瘤相关基因的异常甲基化,推测雌激素对DNMT3B的影响可能是参与子宫内膜恶性转化的机制之一。 第二部分 去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞凋亡的影响及hMLH1基因甲基化的相关研究 目的:检测去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine)对人子宫内膜癌细胞株Ishikawa、HHUA和KLE生物学行为的影响,并研究该药物对DNMT3B与hMLH1基因表达及hMLH1基因甲基化状态的影响,为子宫内膜癌的治疗提供新的作用靶点。 方法: 1.人子宫内膜癌细胞株Ishikawa、HHUA和KLE的培养:细胞在RPMI1640(添加10%FBS,2mM L-谷氨酸)培养基中贴壁生长。 2.细胞活力的检测:实验分为四组:A对照组;B0.1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组:C1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组和D5μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,各细胞株分组培养72h后,使用MTT方法检测细胞活力的变化。 3.观察去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对细胞周期的影响。实验分为两组:A对照组;B1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,药物作用72h后利用流式细胞术检测其对细胞周期的影响。 4.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对细胞凋亡的影响。实验分为两组:A对照组;B 1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,药物作用72h后利用流式细胞术和TUNEL两种方法检测其对细胞凋亡的影响。 5.观察去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞株中hMLH1基因甲基化状态的影响。实验分为两组:A对照组;B 1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,药物作用72h后Methylation-Specific PCR(MSP)检测子宫内膜癌细胞株中hMLH1基因的甲基化状态。 6.观察去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞株中DNMT3B与hMLH1mRNA及蛋白表达的影响。实验分为两组:A对照组:B 1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,药物作用72h后用Real-time PCR和Western blot分别检测DNMT3B与hMLH1表达的变化。 结果: 1.细胞活力的检测: MTT结果显示,去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对细胞活力的抑制呈浓度依赖性,与正常对照相比,1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组可明显抑制细胞的增殖(P<0.05)。5μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组与对照组相比较亦可明显抑制细胞的增殖(P<0.05),但与1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组比较并无显著性差异,因此确定1μM为去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷的作用浓度。观察1μM去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷作用72h后发现其对细胞活力的抑制呈时间依赖性。即去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对细胞活力的抑制呈浓度及时间依赖性。 2.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对内膜癌细胞株细胞周期分布的影响: 实验分为两组:A对照组;B 1μM 5-氮-2′-脱氧胞苷组,药物作用72h后流式细胞术检测细胞周期的分布,发现细胞被阻断在G_2/M期。与对照组相比,药物组中细胞G_2/M期所占的比例增加了大约三倍。 3.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对细胞凋亡的影响: 利用流式细胞术和TUNEL两种方法检测发现5-氮-2′-脱氧胞苷可以显著的诱导细胞凋亡。利用Annexin-V流式细胞术可以检测早期凋亡,从而可以与坏死相鉴别,结果显示药物组早期凋亡的细胞百分比明显高于坏死的细胞,亦明显高于对照组,证明细胞活力的下降是凋亡所导致,而不是坏死。 4.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞株中hMLH1甲基化状态的影响: 通过Methylation-Specific PCR对子宫内膜癌细胞株中hMLH1基因甲基化状态的检测发现去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷可以使hMLH1基因去甲基化从而激活hMLH1基因的表达。 5.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷对子宫内膜癌细胞株中DNMT3B与hMLH1mRNA及蛋白表达的影响: 药物作用72h后利用Real-time PCR和Western blot检测DNMT3B与hMLH1表达水平的变化,发现去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷可以显著抑制DNMT3BmRNA及蛋白的表达,同时增加hMLH1mRNA及蛋白的表达。 结论: 1.去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷可以明显的抑制子宫内膜癌细胞的增殖,使其细胞周期阻断于G_2/M期,诱导细胞的凋亡,为子宫内膜癌的治疗提供一种新的候选药物。 2.初步印证所提出的设想:去甲基化药物5-氮-2′-脱氧胞苷通过抑制DNMT3B的表达使hMLH1去甲基化而被激活,使hMLH1的表达增加。


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